尿素梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳与折叠分析实验

材料与设备

丙烯酰胺

双丙烯酰胺

Tris-乙酸缓冲液（0.5mol/L;pH8.0)

核黄素(0.04mg/ml水溶液)

尿素（晶体;商用超纯级或经去离子处理以除去氰酸盐)

具搅拌平台的线性梯度混合器

N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED)

蠕动泵，带硅胶管的

平板注胶架

注胶用玻板（只用方形板，不用为多孔梳刻有凹槽的玻板)

隔条’（标准胶用的两根侧隔条和两根底隔条）

丁醇，水饱和的

荧光灯

甘油

溴酚蓝（0.1mg/ml)

平板凝胶电泳装置

电源（250V)

考马斯亮蓝染料

操作程序

1)配制下列凝胶溶液：

N液（15%丙烯酰胺；无尿素)

丙烯酰胺(30%;w/v)/双丙烯酰胺(0.8%;w/v)            50ml

Tris-乙酸缓冲液(0.5mol/L;pH8.0)                          10ml

核黄素(0.04mg/ml)                                                12.5ml

H₂0                                                                        27.5ml

总体积                                                                    100ml

D液(11%丙烯酰胺：8mol/L尿素）

丙烯酰胺(30%;w/v)/双丙烯酰胺(0.8%;w/v)             36.7ml

Tris-乙酸缓冲液(0.5mol/L;pH8,0)                            10ml

核黄素(0.04mg/ml)                                                  12.5ml

尿素                                                                         48.1g

H₂O                                                                         4ml

总体积                                                                     100ml

2)凝胶溶液在具侧管的烧瓶中真空脱气。

3)将N液和D液置于梯度混合器的合适位置上，位置视灌胶的方向而定。如从顶部灌胶，则置D液于前置腔（forwordchamber),N液为混合器的限制液(lmiitingsolution)。如从底部灌胶，则置N液于前置腔，D液为限制液。
注：梯度混合器可以用同轴腔式的也可以用并立腔式的，但必须注意将何种溶液放在前置腔。

4)用标准凝胶的底隔条为侧隔条装好玻板。它们通常都需要调整以使它们在铸好的凝胶侧向转动时不会伸出玻板边缘之外。底部用标准的侧隔条。

5)搅拌梯度混合器中的溶液。溶液中各加入100ul TEMEDd打开阀门，开启蠕动泵，流速约1ml/min。最好将此装置置于冷室中，以避免荧光引起聚合作用。
注：体积可增减，以与凝胶浇铸裝置相适应。

6)甩水饱和丁醇覆盖凝胶，直接置于荧光灯下1小时或至凝胶凝结。

7)移出水饱和丁醇，用水洗凝胶的表面。于凝胶顶部插入标准侧隔条。凝胶旋转90°。从凝胶的新的顶部和底部取出隔条。现在尿素的梯度应从一侧向另一侧横贯凝胶。

8)将样品（浓度至少1mg/ml)以10:1与甘油和0.1mg/ml溴酚蓝混合。

9)将凝胶装入电源装置。电泳缓冲液用1:10倍稀释的0.5mol/LTris-乙酸缓冲液（pH8.0)(终浓度50mmol/L)。

10)于凝胶顶部均匀地加上一层样品（50~100Ml)。开始电泳，电流10mA,流向阳极。钙调蛋白是阴离子，在pH8.0时应向阳极移动。

11)取出凝胶，用考马斯亮蓝染色，如附录5中标准Laemmli凝胶所述。