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        用经典 RACE 扩增 cDNA 的5’末端实验

        相关实验:用经典 RACE 扩增 cDNA 的5’末端实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        第 1 阶段:反转录产生 cDNA 模板

        一、材料


        1. 缓冲液、溶液和试剂

        dNTP 溶液(含 4 种 dNTP,各 10mmol/L)

        DTT(0.lmt)l/L)

        TE(10mmol/LTris-HCl、pH7.5,1 mmol/LEDTA、pH8.0)

        2. 酶和缓冲液

        反转录缓冲液,5X(制造商提供)

        RNA 酶 H

        RNasin

        SuperScriptII 逆转录酶(Invitrogen)

        3. 核酸和寡核苷酸

        GSP-RT 引物(100ng/ul)

        poly(A)+RNA 或总 RNA

        4. 特殊设备

        预设为 37°C、42°C、50°C、70°C、80°C 的水浴或加热仪

        二、方法

        1. 在一个无菌的离心管中,于冰浴上混合以下转录成分。

        反转录缓冲液,5X                                             4ul

        dNTP 溶液(含 4 种 dNTP, 各 10 mmol/L)         1ul

        DTT(0.lmol/L)                                                     2ul

        RNasin(40U/ul)                                                   0.25ul

        2. 在另一个管中,混合 0.5ul 的 GSP-RT 引物(100ng/ul) 和 lug poly(A)+RNA 或5ug 总 RNA,再加 13ulH20。80°C 温育 3 min, 迅速在冰上冷却,在离心机中离心 5s。

        3. 将 RNA/引物混合物加入到反转录成分中,然后加 1ul(200U) 的 SuperscriptII 逆转录酶,温和混匀,42°C 保温 1h,然后 50°C 保温 10min。

        4.70°C 溫育 15 min,使逆转录酶失活,然后离心 5s。

        5. 加入 0.75ul(1.5U) 的 RNA 酶 H 到管中,37°C 温育 20 min, 以破坏 RNA 模板。

        6. 用 TE 将反应混合物稀释至 40ul,4°C 保存(这就是 5'末端无尾 cDNA 文库)。

        用经典 RACE 扩增 cDNA 的5’末端实验

        第 2 阶段:在第一链 cDNA 产物末端加 poly(A) 尾
        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        CoCl2(25 mmol/L)

        dATP 溶液(1mmol/L)

        TE(10 mmolTris-HCl、pH7.5,1mmol/LEDTA、pH8.0)

        2. 酶和酶缓冲液

        脱氧核苷酸末端转移酶(Tdt)

        加尾缓冲液,5X(125 mmol/LTris-HCl、pH6.6,lmol/L 二甲胂酸钾,1250ug/ml BSA)

        3. 特殊设备

        Microcon-100 过滤器(Millipore) 或起相同作用的其他产品

        预设为 37°C、65°C 的水浴或加热仪

        二、方法

        1. 用 Microcon-100 过滤器(Millipore) 或起相同作用的其他产品,去除 5'末端无尾cDNA 文库(由上面第 1 阶段第 2 步得到)中的过量引物,按说明进行操作,并用 TE 洗两次以上,总体积不要超过 15ul,用水将总体积调整至 15ul。

        2. 加 4ul 的 5X 加尾缓冲液和 10U 的 Tdt。

        3.37°C 保温 5 min, 然后 65°C 温育 5 min。

        4. 用 TE 将体积稀释至 500ul, 保存于 4°C(这就是 5'末端加尾 cDNA 文库)。

        用经典 RACE 扩增 cDNA 的5’末端实验

        第 3 阶段:扩增
        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        dNTP 溶液(含 4 种 dNTP,各 10 mmol/L)

        TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,1mmol/LEDTA、pH8.0)

        2. 酶和酶缓冲液

        HerculesHot-Start 聚合酶(Stratagene)

        HerculesHot-Start 聚合酶缓冲液(10X)

        3. 核酸和寡核苷酸

        5'末端加尾的 cDNA 库(由上面第 2 阶段得到)

        寡核苷酸引物 Qo、QT 和 GSPl(Q0 和 QT 的序列见图 25-2)

        4. 特殊设备

        可设程序的热循环仪

        二、方法

        1. 第一轮

        (1) 在一个无菌的 0.2 ml 离心管中混合以下成分。

        HerculesHot-Start 聚合酶缓冲液(10X)      5ul

        dNTP 溶液(10 mmol/L)                            1.0ul

        Hercules Hot-Start 聚合酶                         2.5U

        H20                                                            至 50ul

        (2) 加 1ul 的 5'末端加尾 cDNA 文库(来自第 2 阶段第 4 步)和 GSP1,Q0[见图 25-2(b)] 和 QT 引物各 25pmol。

        (3) 混匀并在 DNA 热循环仪上 98°C 加热 5 min, 使第一链产物变性,并激活聚合酶。冷却至 48°C 退火 2 min, 然后 72°C 延伸 40 min。

        (4) 按下列程序进行 30 个扩增循环。

        用经典 RACE 扩增 cDNA 的5’末端实验

        2. 第二轮

        (5) 取出部分第一链扩增产物,用 TE 以 1:20 稀释。

        (6) 用上面的程序,但省略掉 2 min 的退火和 72°C40 mm 的延伸步骤,用 Q1 引物和 GSP2 引物扩增 1ul 上述稀释材料。

        用经典 RACE 扩增 cDNA 的5’末端实验

        来源:丁香实验

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