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        FDD-PCR 实验

        相关实验:FDD-PCR 实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        矿物油(可选)

        2. 核酸和寡核苷酸

        来自方案 3 的 cDNA

        3. 专用设备

        热循环仪 [推荐使用 GeneAmpPCRSystem9600(Perkin-Elmer),或者 Mastercyder(EppendorfScientific)]

        0.2 ml 薄壁 PCR 管

        4. 附加试剂

        RNAspectraFluorescentmRNA 差异显示系统(GenHunterF501~F510&R501-R510),包括蒸馏水、10XPCR 缓冲液(100mmol/LTris-HCl、pH8.4,500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2,0.01% 明胶)、FDDdNTP 混合液(2.5 mmol/L)、荧光锚定引物(FH-TUM)(2umol/L) 以及任意引物(H-AP)(2umol/L)

        二、方法

        1. 在不同的 1.5 ml 离心管中,为每个 FH-TUM 锚定引物单独配制一个 FDD-PCR 主体混合液。

        蒸馏水                                                                 91.8ul

        10XPCR 缓冲液                                                   18.0ul

        FDDdNTP 混合液                                                 14.4ul

        FH-T11M 引物(M=G、A 或 C)                            18.0ul

        Taq DNA 聚合酶(Qiagen201207Valencia,CA) 1.8ul

        2. 将热循环仪的程序设置为:94°C15s→40°C2 min→72°C60s→40 个循环→4°C 平衡。
        如果使用的不是推荐的热循环仪,那么将变性(94°C)'时间调整为 30s。

        3. 各取 16ul 相应的 FDD-PCR 主体混合液,加到标记好的 0.2 ml 薄壁 PCR 管中。例如,将 8 个管子标记为锚定引物 FH-T11 G 与任意引物 H-AP1~8 的组合,同样标记好所有的 24 个引物组合,包括 FH-T11A 与 H-AP1~8 和 FH-T11C 与 H-AP1~8。

        4. 在每个 0.2 mlPCR 管中,加入 2.0ul 相应的 cDNA(来自方案 3 的 RT 反应)。

        5. 在每个 0.2 mlPCR 管中,加入 2.0ul 相应的 H-AP, 混匀,总反应体积为 20ul。如果需要,加入 25ul 矿物油。

        6. 将 0.2 mlPCR 管放到热循环仪中,开始运行程序(见第 2 步)。完成后,反应产物在黑暗中-20°C 保存。

        来源:丁香实验

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