冷冻组织及切片的准备实验

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

丙酮

蒸馏水

干冰

磷酸盐缓冲液（PBS)

Tek OCT 组织复合物（Sakura FinetekUSA，Torrance，CA)

2. 特殊设备

封闭容器

烧杯

恒冷装置

解剖工具

平盘

可以削去的一次性组织模子（Pelco International，Redding，CA)

普通的无粘片剂的载玻片

Sakura 刀片（IMEB，SanMarcos，CA)

3. 细胞和组织

新鲜的组织（见二、方法中的（2））

二、方法

1. 冷冻组织的准备

(1) 盖上盛有包埋介质的模子（推荐使用 Tek O C T 组织复合物），准备干冰-丙酮浴(在烧杯中简单混合干冰和丙酮）。

(2) 处死动物并取出目的组织与包埋介质混合。

(3) 放组织于冷模子底上。为了便于利用恒冷装置，反向放目的切面于冷模子底上。

(4) 将冷模子的底部放于干冰-丙酮浴的表面，这样样品将在 3~4 min 内逐渐冷却。当品冷冻后将呈现白色。在冷冻时不要将模子掉入丙酮中。

(5) 从模子中移去组织，放于-80°C 直到切片。如果组织样品放置时间较长，将其放盛有冷的蒸馏水的密封容器中以保持湿度。

2. 切片及保存

(1) 取冷冻的样品置于含 O C T 复合物的低温冷箱中，采用标准的冷冻组织切片法。

(2) 让样品与冷箱中温度（-25~-20°C) 平衡 15~20 min。如果样品在切片时组织块太冷，平衡时间可以适度延长。

(3) 将准备用于 LCM 的切片（厚度 1~5um) 放于普通的无粘片剂的载破片上。如果组织粘于载玻片上太紧，可能不利于后续的 LCM 操作。

(4) 放置好后，立即放到干冰上。如果当天做 LCM，片子应当放在干冰上。否则，应储存于-80°C。