冷冻组织切片上的荧光免疫检验
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一、材料与试剂
1. 第一抗体
2. 第二抗体（Invitrogen）
3. 100%冰冷丙酮
4. 马血清（SantaCruz;sc-2483）
5. Hoechst 33342荧光染料（Invitrogen;H1399）
6. ProLong Gold抗褪色试剂（Invitrogen;P36934）
7. 免疫组化笔（Sigma;Z377821）
8. 指甲油（FisherScientific;50-949-071）
9. PBS
10. 甲醛
11. 甲醇
12. TritonX-100
二、仪器
1. -20°C冰箱
2. 湿盒
三、步骤
1. 从冷藏室取出7 μm 的冻干切片并立刻放入冰冷的丙酮中浸泡10分钟。注，可选的固定条件依赖于所使用的抗原及一抗。常用的固定剂有甲醛、丙酮及甲醇。
2. 用PBS洗涤载片后吸干组织周围的水份，使载片干燥。小心地用PAP笔绕组织圈出轮廓。
3. 将切片用含有0.05%TitonX-100的PBS混合10%的马血清溶液在室温下封闭1小时。
4. 吸干封闭缓冲液，切片放入湿盒中与含有0.05%TritonX-100的PBS配制的2%马血清溶液稀释的第一抗室温体孵育1小时。用足量的抗体溶液完全浸没切片，约150微升。提示,按照推荐方法稀释抗体。
5. 吸去第一抗体并用150 μl 的PBS/TritonX-100缓冲液洗涤5次。
6. 切片在湿盒中与相应的第二荧光抗体AlexaFluor488/555antibody（MolecularProbes）室温孵育1小时。二抗用含有0.05%TritonX-100的PBS配制的2%马血清溶液稀释，比例为1：300，用足够量的二抗溶液（约150 μl）以完全浸没切片。
7. 吸去二抗并用150 μl 的PBS/TritonX-100缓冲液洗涤2次。
8. 用150 μl 的PBS缓冲液洗涤切片3次。
9. 将切片与Hoechst 33342核染料[2 mg/ml 溶于PBS中]孵育2分钟。
10. 吸去二抗并用150 μl 的PBS缓冲液洗涤3次。
11. 让切片干后，每个切片中加约2滴的ProLongGold抗褪色试剂，盖上盖玻片。注意，要小心避免太过滑动盖玻片而损坏组织，不要造成气泡。吸去多余的试剂。
12. 避光放置在室温下几个小时或过液让切片干燥。一旦载片完全变干，用干净的指甲油封住盖玻片的边沿。封片可以避光存放于-20°C几周时间。
