亚甲基蓝介导的光交联反应检测蛋白质与双链RNA的相互作用实验

亚甲基蓝介导的光交联反应是对紫外交联反应的一个补充。亚甲基蓝属于酚噻嗪类染料。由于其环结构，亚甲基蓝可以在较低的浓度同核酸结合，插入碱基。浓度较高时，亚甲基蓝带阳离子，可以与磷酸二酯骨架通过静电力结合。

一、材料与设备

1. 亚甲基蓝（MB）水溶液，2.5 mg/ml。-20℃ 避光保存。

2. [ α-³²P ] 标记的 RNA。如果转录模板未被 DNase 消化，dsDNA 可以同 MB 结合而增加交联反应所需的 MB 浓度。如果操作中便用互补的 ssRNA 则需要先对其进行退火 ( 将同位素标记的 RNA  2~5 倍的互补末标记 RNA 混合，加热 5 min，室温缓慢冷却。通常在实验开始前进行 RNA 的退火）。

3. 10X 结合缓冲液，配方根据实际操作情况确定，通常情况下，1X 结合缓冲液中含 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，20~100 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl₂，0.5 mmol/L DTT。

4. RNase 储存液。

RNase A：10 mg/mL RNase A 溶解于 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 )，15 mmol/L NaCl，煮沸 15 min，缓慢冷却后 -20℃ 保存。

RNase T1：100000 U/ml。

RNase V1：700 U/ml。

5. 5X SDS 上样缓冲液：10% SDS，1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8)，50% 甘油，0.03% 溴酚蓝，室温保存，用前补加 5% β 巯基乙醇。

6. 1 mol/L 维生素 C 水溶液（以 DEPC 水溶解），最好用前现配。

二、操作方法

1. 10 μl 结合反应体系加入 1 μl 10X 结合缓冲液，5~10 ng [ α-³²P ]标记的RNA，100 ng 纯化蛋白或 10 μg 蛋白粗提物，补水至 10 μl。室温反应 5~10 min ( 反应条件需根据检测的蛋白和核酸来调整）。

2. 将反应管置于冰浴中，加入适量的 2.5 mg/ml MB 母液至终浓度为 0.1 ng/μl~ 2 ng/μl，吹打混匀；加入适量的维生素 C 和所加维生素 C 的 2 倍摩尔数的 Tris-HCl，（pH 7.8 ) 以调整反应液的 pH，吹打混匀。

3. 光照 5~20 min。

4. 制备 10X RNase 混合液：10 μg/μl RNase A，3 U/μl RNase T1，0.35 U/μl RNase V1。在每管反应液中加入 1 μl 10X RNase 混合液 37℃ 反应 30 min ( 如果试验中使用的是纯化的蛋白，此步可以省去）。

5. 加入 4 μl 5X SDS 上样缓冲液，电泳。

6. 电泳后可先对胶进行考马斯亮蓝染色，以观察上样是否一致或是否出现由于 MB 过量引起的蛋白-蛋白间交联。之后，X 射线片放射自显影（dsRNA 与蛋白的交联复合物在放射自显影的结果中显示出阳性条带）。