方案5.9 Fe（II）-EDTA保护测定法

Fe（II）-EDTA 能够催化 RNA 或 DNA 的断裂，是 RNase 保护分析的一个补充方法，其优点是很少或没有碱基序列的特异性，其沿着整个长度的 RNA 或 DNA 链的剪切几乎是一致的，它可被用于解释一些 RNA 的较高级的折叠方式。

一、材料与设备

1. 水浴。

2. 垂直电泳装置。

3. 暗片盒。

4. RNA 洗脱缓冲液：80% 甲酰胺，40 mmol/L PIPES，1 mmol/L EDTA，0.4 mol/L NaCL。

5. 退火缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 )，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl₂。

6. (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ 溶液：10 mmol/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ ( Sigma 公司），20 mmol/L EDTA，用前摇匀。

7. 100 mmol/L 硫脲。

8. 0.9% H₂O₂。

9. 10 mmoI/L 抗坏血酸钠。

二、操作方法

1. 制备 RNA：通过 PAGE 纯化末端标记的 RNA，用 RNA 洗脱缓冲液抽提含有 RNA 的凝胶条块，再用乙醇沉淀 RNA。

2. 退火：以使 RNA 形成适当的结构。用 50 μl 的退火缓冲液将 RNA 浓度调整为 25 mmol/L，95℃ 加热 2 min后，置于冰上 1 h。

3. 反应：将 7 μl 的 RNA、1 μl 10 mmol/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ 溶液，1 μl 10 mmol/L 抗坏血酸钠和 0.9% 的 H₂O₂ 混合，于 20°C 温育 10 min 后加入 1 μl 100 mmol/L 硫脲以终止自由基反应。

4. 检测：用含 8 mol/L 尿素的 10%~15% PAGE 和放射自显影对切割产物进行分析。