材料与仪器
| 试剂、试剂盒 | |
|---|---|
| 仪器、耗材 |
步骤
一 材料与设备
1)AE 缓冲液：50 mmol/L 乙酸钠 (PH5.3)，lOmmol/LEDTA。
2) 苯酚 (用 AE 缓冲液预先平衡）。
3)10%SDS
4) 酚：氯仿（1:1)。
5) 氯仿
6) 无水乙醇及 80% 乙醇.
7)3mol/L 乙酸钠
8) 无 RNase 的水
9) 髙速离心机。
二 操作方法
1) 离心收集 l0 ml 酵母细胞培养物，用 40ulAE 缓冲液重悬。转移到 1.5 ml 离心管中。
2) 加入 40ul10%SDS，混匀，再加入等体积 (440u1) 苯酚，涡旋混匀。
3)65°C 温育 4mim, 干冰/乙醇浴迅速冷却直至出现苯酚结晶，最大转速离心 2 min,. 上清转移到一新管中。
4）加入等体积酚：氯仿抽提，离心 5 min, 上清转移到新管中，加入 0.1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠（pH5.3) 及倍体积无水乙醇，一 20℃ 沉淀 30 min。
5) 以 12000 g，于 4℃ 离心 lOmin, 冉以 lml80% 乙醇漂洗沉淀。干燥后，RNA 溶于 20ul 无 RNase 的水中, 于-70℃ 保存。
1)AE 缓冲液：50 mmol/L 乙酸钠 (PH5.3)，lOmmol/LEDTA。
2) 苯酚 (用 AE 缓冲液预先平衡）。
3)10%SDS
4) 酚：氯仿（1:1)。
5) 氯仿
6) 无水乙醇及 80% 乙醇.
7)3mol/L 乙酸钠
8) 无 RNase 的水
9) 髙速离心机。
二 操作方法
1) 离心收集 l0 ml 酵母细胞培养物，用 40ulAE 缓冲液重悬。转移到 1.5 ml 离心管中。
2) 加入 40ul10%SDS，混匀，再加入等体积 (440u1) 苯酚，涡旋混匀。
3)65°C 温育 4mim, 干冰/乙醇浴迅速冷却直至出现苯酚结晶，最大转速离心 2 min,. 上清转移到一新管中。
4）加入等体积酚：氯仿抽提，离心 5 min, 上清转移到新管中，加入 0.1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠（pH5.3) 及倍体积无水乙醇，一 20℃ 沉淀 30 min。
5) 以 12000 g，于 4℃ 离心 lOmin, 冉以 lml80% 乙醇漂洗沉淀。干燥后，RNA 溶于 20ul 无 RNase 的水中, 于-70℃ 保存。
注意事项
用 PH 8. 0 的 Tris-Cl 平衡的苯酚代替 AE 平衡酚也可取得良好的效果。
来源：丁香实验
