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        酵母感受态细胞的制备方法

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        酵母感受态细胞制备可以:(1)用于建立酵母转化体系;(2)用于酵母表达系统 构建;(3)用于酵母其他分子生物学研究。

        一、试剂与耗材

        1. 试剂

        细菌用-酵母提取物(Fisher)、 细菌用-蛋白胨(Fisher)、葡萄糖(Fisher)、细菌用-琼脂粉、去离子水、甘油(Sigma)、二甲基亚砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸锂(Sigma)、鲑鱼精子细胞DNA (Invitrogen)、酵母无氨基酸氮源(Sigma)、 2-(N-吗啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。

        2. 仪器

        水浴锅(VWR)、离心机(Eppendorf)、30 °C摇床与恒温培养箱(VWR)、培养皿。

        二、 试剂配方

        1. YPDA液体或固体培养基

        (1)1%酵母提取物: 10 g/L

        (2)2%胰蛋白胨: 20 g/L

        (3)2%葡萄糖:20 g/L

        2. 转化液

        (1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 μl

        (2)1 M醋酸锂:36 μl

        (3)SsDNA(10 mg/ml):10 μl

        (4)质粒:3 μl

        (5)总计:360 μl

        3. YNB+ MA 培养基(100 ml)

        (1)YNB:0.67 g

        (2)2-(N-吗啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g

        (3)腺嘌呤:0.01 g

        (4)琼脂粉:2g

        (5)葡萄糖:2g

        三、制备步骤

        1. 在转化实验的两天前,于YPDA培养基的平皿上活化酵母菌株。

        2. 转化前一天,挑取活化的酵母细胞(单克隆)于YPDA液体培养基中,30°C,200 rpm培养过夜。

        3. 将培养过夜的酵母细胞液按1:3的比例转接与新的YPDA液体培养基中,于30°C摇床内,200 rpm培养4 h。

        4. 3 000 g 离心 5分钟收集酵母细胞,用0.5倍体积的无菌水洗酵母细胞。

        5. 再次3 000 g 离心 5分钟。

        6. 用0.01倍体积的无菌水重悬酵母细胞,并转入适宜的离心管中,20°C ,3 000 g 离心 5分钟。

        7. 用0.01倍体积的无菌细胞悬浮液(5 % v/v 甘油,10% v/v 二甲基亚砜)重悬酵母细胞。

        8. 将重悬的酵母细胞按50 ul分装到1.5 ml离心管中。

        9. 将管放入塑料盒或者纸盒中(逐步梯度冷冻能够增强酵母的存活率)。

        10. 将装有酵母细胞的盒子放入-80°C冰箱。(细胞在-80°C能够保存一年以上)。

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