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        细胞系

        相关实验:斑马鱼胚胎细胞的培养

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        鳟鱼胚胎提取物:

        (a)收集胚胎(受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鳟鱼种系,在 10°C 条件下饲养,或者受精后 3 天的斑马鱼,在 28°C 条件下饲养),在 -80°C 条件下冻存

        (b)为了制备提取物,将约 150 g 胚胎融化后,采用 Tissuemizer 匀浆器(Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上匀浆 2 min

        (c)将匀浆通过数层纱布过滤后去除绒毛膜,然后在 4°C 条件下离心(20000 g,30 min )

        (d)离心后收集上清液,留下表面的亮橘色脂层

        (e)将上清液移入 1 只新离心管,按操作步骤(c ) 离心

        (f)收集上清液,留下剩余的脂质,然后在 4°C 条件下超速离心(100000 g,60 min )

        (g)超速离心后收集上清液,留下脂层。用 LDF (1 : 10 ) 稀释上清液,然后过滤除菌

        (h)提取物过一系列滤器(1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )过滤

        (i)将提取物按 0.5 ml 分装后,在 -80°C 条件下冻存

        (j)为了用提取物培养细胞,测量蛋白质浓度(见方案 21.4 ),然后用 LDF 将提取物稀释至理想的工作浓度

        (k)将稀释的提取物在 4°C 条件下冷藏,最长 2 个月

        BRL 细胞条件培养液:

        (a)在 37°C 条件下和在 75 cm2 培养瓶中,用 DMEM/F12/10FB 培养液培养 BRL 细胞(ATCC )

        (b)当细胞汇合时,用添加 2% FBS 的 LDF 置换 FD 培养液,在 37°C 条件下培养

        (c)5 天后吸出 LDF,过滤,在 -20°C 冻存

        (d)向细胞中加入新鲜的 LDF,5 天后重复此过程。条件化的 LDF 培养液可从同一个培养瓶中收集 3 次。然后,将细胞分开培养,使细胞再次汇合

        1. 用 LDF 维持培养液培养从早期斑马鱼胚胎获得的细胞如 ZEM-2,至约 70% 汇合。

        2. 在 26°C 和环绕空气的条件下培养细胞。

        3. 约每 5 天换培养液1 次。

        4. 经胰蛋白酶消化,继代培养(见方案13.2 )。

        已表明鳟鱼血清和胚胎提取物剌激其他鱼类胚细胞的生长 [ Cdlodi and Bames,1990 ] 。

        来源:丁香实验

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