成纤维细胞饲养层

通过用链酶蛋白酶除去绒毛膜、用添加成分的 FGF 培养液培养细胞和采用不同的胰蛋白酶消化筛选成纤维细胞，用原肠胚期斑马龟的胚胎成纤维细胞制备饲养层 [ Sun et al., 1995a ]。

鳟鱼胚胎提取物：

(a)收集胚胎（受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鳟鱼种系，在 10°C 条件下饲养，或者受精后 3 天的斑马鱼，在 28°C 条件下饲养），在 -80°C 条件下冻存

(b)为了制备提取物，将约 150 g 胚胎融化后，采用 Tissuemizer 匀浆器（Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上匀浆 2 min

(c)将匀浆通过数层纱布过滤后去除绒毛膜，然后在 4°C 条件下离心（20000 g，30 min )

(d)离心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂层

(e)将上清液移入 1 只新离心管，按操作步骤（c ) 离心

(f)收集上清液，留下剩余的脂质，然后在 4°C 条件下超速离心（100000 g，60 min )

(g)超速离心后收集上清液，留下脂层。用 LDF (1 : 10 ) 稀释上清液，然后过滤除菌

(h)提取物过一系列滤器（1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )过滤

(i)将提取物按 0.5 ml 分装后，在 -80°C 条件下冻存

(j)为了用提取物培养细胞，测量蛋白质浓度（见方案 21.4 )，然后用 LDF 将提取物稀释至理想的工作浓度

(k)将稀释的提取物在 4°C 条件下冷藏，最长 2 个月

BRL 细胞条件培养液：

(a)在 37°C 条件下和在 75 cm² 培养瓶中，用 DMEM/F12/10FB 培养液培养 BRL 细胞（ATCC )

(b)当细胞汇合时，用添加 2% FBS 的 LDF 置换 FD 培养液，在 37°C 条件下培养

(c)5 天后吸出 LDF，过滤，在 -20°C 冻存

(d)向细胞中加入新鲜的 LDF，5 天后重复此过程。条件化的 LDF 培养液可从同一个培养瓶中收集 3 次。然后，将细胞分开培养，使细胞再次汇合

1. 收集约 30 个受精后 8 h 的胚胎。

2. 通过链酶蛋白酶处理，除去绒毛膜 [ Sun et al.，1995a ]。

3. 用胰蛋白酶孵育胚胎 1 min，同时用吸管轻轻吹打，以便使细胞分散。

4. 加入 FBS (终浓度为 10 % ) ，终止胰蛋白酶的消化。

5. 离心（500 g ，10 min ) ，收集细胞。

6. 用 5 ml 含有 PGF 的 LDF 原代培养液混悬细胞，然后将细胞移入 25 cm² 培养瓶。

7. 在 26°C 条件下，让细胞贴壁和汇合。

8. 当细胞汇合时，用同样的培养液传代。

9. 培养 2~3 代后，上皮细胞和成纤维细胞将混合出现。这些细胞可用含有 10% FBS 的 LDF 基础培养液维持培养。通过不同的胰蛋白酶消化，为下一步培养筛选成纤维细胞。

(a)用胰蛋白酶处理细胞 1 min 以除去大部分成纤维细胞，保留贴在瓶壁上的上皮细胞。

(b)将成纤维细胞移入另 1 个培养瓶。当细胞汇合时，重复以上过程。

(c)培养 2~3 代后，细胞均为成纤维细胞。

10. 制备生长抑制的成纤维细胞饲养层：

(a)将细胞加入合适的培养皿或培养瓶，使成纤维细胞生长成为汇合的单层。

(b)将 10 μg/ml 丝裂霉素 C 加入成纤维细胞中，在 26°C 条件下处理 3 h。

(c)用 LDF 浸洗 3 次后，可将生长抑制的成纤维细胞用作斑马鱼胚细胞培养的伺养层。