方案27.4 间隔性摄像

用合适光学显微镜特性的培养小室培养细胞。显微镜装有气记录仪连接的摄像机，附加设备为细胞培养提供理想的温度。在记录过程中，通过控制器触发每次曝光。控制器也控制快门，以便排除对细胞不必要的照明。

1. 打开所有设备的开关，特别是加热器。最好先打开加热器的开关，使透明塑胶箱（将显微镜封入，装有1 个可控加热系统。这个可控加热系统是用控制器（2082793)、温度探棒（2194674)、加热器元件（224565)和低噪音交流电风机（583-325)定制的（RS Components，UK )）内的温度恒定。

2. 用胰蛋白酶和 EDTA 混合液（0.25% 胰蛋白酶（Difco) 和 0.5 mmol/L EDTA ）消化黏附的培养细胞，制成细胞悬液。

3. 在皮氏培养皿中的盖玻片（18 mm×18 mm , No 1.5 ( Merck )。用浓硫酸浸洗后，在超纯水中用 Teflon 盖玻片容器（Eppendorf ) 反复煮沸，最后用高压灭菌器灭菌。）上接种约 20000 个细胞，在 37°C 和含 3% CO₂ 的湿润条件下将细胞放置过夜。

4. 将盖玻片封在菲薄小室上。小室应充满培养液（MEM，含有 Hank’s 盐、12 mmol/L 碳酸氢钠、10% 小牛血清和 4 mmol/L L-谷氨酰胺。），并留 1 个小气泡以确保由 Hank’s 盐平衡 CO₂。用热蜡混合物原位封固盖玻片。

菲薄小室：

(a)1 mm 厚的玻璃片，中央有 1 个直径为 15 mm 的孔。用 #3 盖玻片将孔盖住，再用紫外线处理的玻璃胶（Southern Watch and Clock Supplies) 将盖玻片粘到有孔玻片上。

(b)用 70 % 乙醇将小室消毒，随之用清洁的空气吹干。

(c) 蜡混合物：蜂蜡（Fisher )、软黄色石蜡（Fisher ) 和石蜡（熔点为 46°C；Fisher )，以 1 : 1 : 1 的比例配制。


5. 应用相应的显微镜（Axiovert 135 TV ( Zeiss)）技术，例如有 LD 消色平场 32×/0.4Ph2 物镜的位相差和荧光。较短工作距离的高放大率物镜需配有正置显微镜，以便观察在小室顶上运动的贴壁细胞。

6. 为获取图像准备计算机：

(a)用镜台测微尺标定图像大小。

(b)选择曝光时间。通常 0.1s 对于位相差图像是足够的，而弱的荧光图像需较长的曝光时间，0.4s 或 0.4s 以上。

(c)选择摄像间隔时间、图像数目和文件名。分析细胞在缓慢运动中的移位时，成纤维细胞样的细胞在 5 min 间隔中将有满意结果。观察变化较快细胞的形态时，将需要 1 min 或甚至更短的间隔时间。另外，快速运动细胞的移位将需要 1 min 或更短的间隔时间，如中性白血细胞。

(d)按下列程序以便交替出现相差图像和荧光图像：

(i)建立编入索引的文件名，以便于保存。

(ii)插入 START 标记。

(iii)使用荧光滤片轮，打开弧灯快门。

(iv)用适当的曝光时间充分获取荧光图像。

(V)使用相差滤片轮，关闭弧灯快门。

(vi)保存荧光图像。

(vii)打开卤素灯快门。

(viii)用适当的曝光时间充分获取相差图像。

(ix)关闭卤素灯快门。

(x)保存相差阁像。

(xi)暂停间隔记录。

(xii)关闭所有程序窗口。

(xiii)消除 START 标记，除非已经记录了指定数目的图像。

(xiv)停止程序。

可分别观察分开记录的相差和荧光摄像结果或用 IPLab 软件结合起来观察。

7. 用 CD 刻录机储存图像结果。