原理
本方法是由 Marelli-Berg 等 [ 2000 ] 的方法改写的。
材料与仪器
步骤
1. 将心脏放入盛有约 5 ml HBSS/PS（HBSS，添加 150 U/ml 青霉素和 150 μg/ml 链霉素） 的 Petri 培养皿。
2. 除去主动脉和肺动脉等与心脏相连的血管。
3. 将心脏（小鼠心脏：放入含有 300 U/ml 青霉素和链霉素混合液、50 μg/ml 庆大霉素的 HBSS/PSG）切成两半，取出较大的血块和掉落的结缔组织。
4. 将心脏放入盛有 CMF （不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS，添加 150 U/ml 青霉素和 150 μg/ml 链霉素胰蛋白酶和 EDTA 混合液（如Sigma））的 Petri 培养皿，冲洗后换人新鲜 CMF 。
5. 用手术刀将培养皿中的标木切成小块。
6. 将组织块悬起，再让其沉下，由此用 CMF 洗组织块。
7. 用手术刀片取组织块，然后移入盛有 10 ml 现配制的温胶原蛋内酶 A （胶原蛋白酶A : 是从溶组织梭状芽孢杆菌提纯的（103586，Roche）。1 mg/ml，用 HBSS 配制 10 ml。用时现配，过滤灭菌）（1 mg/ml）的容器。
8. 在 37°C 条件下孵育 30 min，同时搅动组织块。
9. 加入 CMF。
10. 摇动组织块，然后让其沉下，由此分散细胞。将细胞悬液移人试管。
11. 重复步骤 9 和步骤 10 几次。
12. 将细胞悬液离心（300 g，8 min）。
13. 轻轻吸去上清液，避免搅动细胞。
14. 用 5 ml 胰蛋白酶和 EDTA 混合液将细胞混悬，通过用吸管吹打将成团的细胞分散，然后在 37°C 条件下孵育 10 min。
15. 将 10 ml 含 1 % FS 的 HBSS/FB 加入已消化的组织和细胞，用孔径为 70 μm 的细胞滤器过滤。 .
16. 用 20 ml 冷 HBSS/FB 冲洗细胞滤器内的组织。
17. 将滤液中的细胞离心（300 g，8 min）。
18. 轻轻吸去上清液，保留细胞。
19. 加入约 5 μg 无相关抗体（如 OKT4/OKT8），轻弹试管以分散细胞。在冰上孵育 20 min，阻断 Fc 受体。
20. 加入 5 μg 大鼠抗小鼠内皮糖蛋白（endoglin）抗体（克隆 MY7/18），轻弹试管，在 4°C 条件下孵育 20 min。
21. 加入 30 ml HBSS，在 4°C 条件下离心（300 g，8 min）。
22. 加入 50 μl 山羊抗大鼠免疫微珠（用 20 μl HBSS 配制）。
23. 在 4°C 条件下孵育 15 min。
24. 加入 30 mlHBSS，洗免疫微珠，然后在 4°C 条件下离心（300 g，8min）。
25. 按照生产厂家的说明，将 MidiMacs 柱放在磁体上，用 500 μl 含有 1 % FCS 的 HBSS 洗 MidiMacs 柱。
26. 将 3 ml 含有 1 % FBCS 的 HBSS 加入试管，然后将微珠悬液加入 MidiMacs 柱。
27. 用 1 ml HBSS/FB 洗 3 次，随后用 500 μl 生长培养液洗。
28. 取出 MidiMacs 柱，放入 15 ml 试管，然后加入 4 ml MCEC 生长培养液（MCEC 生长培养液：含有 25 mmol/L 葡萄糖和 4 mmol/L L-谷氨酰胺的 DMEM，添加 10 % FBS、150 U/ml 青霉素、150 μg/ml 链霉素和从牛脑提纯的内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growth supplement，ECGS））。放入柱塞，收集结合于微珠的细胞。将细胞悬液移人明胶预涂的 25 cm2 培养瓶。
29. 为了保存非内皮细胞，将 MidiMacs 柱的洗液离心，接种于 25 cm2 培养瓶，用添加 15 % FBS 的 DMEM （含有 1000 mg 葡萄糖）培养。
维持培养
30. 每周换培养液 2 次。如果细胞单层 <50 % 时半换液。如果细胞单层达 50 %~ 80 % 时，全部换液。
31. 细胞单层达 80 % 时，用胰蛋白酶和 EDTA 混合液消化后按 1 : 3 传代。
32. 不要用超过 3 代的细胞。
2. 除去主动脉和肺动脉等与心脏相连的血管。
3. 将心脏（小鼠心脏：放入含有 300 U/ml 青霉素和链霉素混合液、50 μg/ml 庆大霉素的 HBSS/PSG）切成两半，取出较大的血块和掉落的结缔组织。
4. 将心脏放入盛有 CMF （不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS，添加 150 U/ml 青霉素和 150 μg/ml 链霉素胰蛋白酶和 EDTA 混合液（如Sigma））的 Petri 培养皿，冲洗后换人新鲜 CMF 。
5. 用手术刀将培养皿中的标木切成小块。
6. 将组织块悬起，再让其沉下，由此用 CMF 洗组织块。
7. 用手术刀片取组织块，然后移入盛有 10 ml 现配制的温胶原蛋内酶 A （胶原蛋白酶A : 是从溶组织梭状芽孢杆菌提纯的（103586，Roche）。1 mg/ml，用 HBSS 配制 10 ml。用时现配，过滤灭菌）（1 mg/ml）的容器。
8. 在 37°C 条件下孵育 30 min，同时搅动组织块。
9. 加入 CMF。
10. 摇动组织块，然后让其沉下，由此分散细胞。将细胞悬液移人试管。
11. 重复步骤 9 和步骤 10 几次。
12. 将细胞悬液离心（300 g，8 min）。
13. 轻轻吸去上清液，避免搅动细胞。
14. 用 5 ml 胰蛋白酶和 EDTA 混合液将细胞混悬，通过用吸管吹打将成团的细胞分散，然后在 37°C 条件下孵育 10 min。
15. 将 10 ml 含 1 % FS 的 HBSS/FB 加入已消化的组织和细胞，用孔径为 70 μm 的细胞滤器过滤。 .
16. 用 20 ml 冷 HBSS/FB 冲洗细胞滤器内的组织。
17. 将滤液中的细胞离心（300 g，8 min）。
18. 轻轻吸去上清液，保留细胞。
19. 加入约 5 μg 无相关抗体（如 OKT4/OKT8），轻弹试管以分散细胞。在冰上孵育 20 min，阻断 Fc 受体。
20. 加入 5 μg 大鼠抗小鼠内皮糖蛋白（endoglin）抗体（克隆 MY7/18），轻弹试管，在 4°C 条件下孵育 20 min。
21. 加入 30 ml HBSS，在 4°C 条件下离心（300 g，8 min）。
22. 加入 50 μl 山羊抗大鼠免疫微珠（用 20 μl HBSS 配制）。
23. 在 4°C 条件下孵育 15 min。
24. 加入 30 mlHBSS，洗免疫微珠，然后在 4°C 条件下离心（300 g，8min）。
25. 按照生产厂家的说明，将 MidiMacs 柱放在磁体上，用 500 μl 含有 1 % FCS 的 HBSS 洗 MidiMacs 柱。
26. 将 3 ml 含有 1 % FBCS 的 HBSS 加入试管，然后将微珠悬液加入 MidiMacs 柱。
27. 用 1 ml HBSS/FB 洗 3 次，随后用 500 μl 生长培养液洗。
28. 取出 MidiMacs 柱，放入 15 ml 试管，然后加入 4 ml MCEC 生长培养液（MCEC 生长培养液：含有 25 mmol/L 葡萄糖和 4 mmol/L L-谷氨酰胺的 DMEM，添加 10 % FBS、150 U/ml 青霉素、150 μg/ml 链霉素和从牛脑提纯的内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growth supplement，ECGS））。放入柱塞，收集结合于微珠的细胞。将细胞悬液移人明胶预涂的 25 cm2 培养瓶。
29. 为了保存非内皮细胞，将 MidiMacs 柱的洗液离心，接种于 25 cm2 培养瓶，用添加 15 % FBS 的 DMEM （含有 1000 mg 葡萄糖）培养。
维持培养
30. 每周换培养液 2 次。如果细胞单层 <50 % 时半换液。如果细胞单层达 50 %~ 80 % 时，全部换液。
31. 细胞单层达 80 % 时，用胰蛋白酶和 EDTA 混合液消化后按 1 : 3 传代。
32. 不要用超过 3 代的细胞。
来源：丁香实验
