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        卵和胚胎细胞总RNA提取

        相关实验:卵和胚胎细胞总 RNA 提取

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一 材料与设备

        1)5%TritonX-100

        2) 匀浆缓冲液:50 mmol/LNaCl,50 mmol/LTris-Cl,(PH7.5),5 mmol/LEDTA(pH8.0),0.5%SDS,200ug/ml 蛋甶酶 K

        3) 酚:氯仿 (1:1)

        4)3mol/L 乙酸钠 (pH5.2)。

        5) 乙醇

        6)8mol/L 氯化锂


        二 操作方法

        1) 将待处理的组织放置下一个干烤过的玻璃匀浆器内,弃去无关的液体,用 0.5% TriwnX-100 洗涤蝇胚,以去除培养基。

        2) 加 10 倍体积的匀浆缓冲液、立即研磨使组织彻底匀浆化。

        3) 于 37℃ 将组织匀浆温育 l h, 间或混匀之。

        4)将匀浆移至离心管内,加等体积酚:氯仿(1:1),剧烈振荡 1 min,用吊桶式转头于室温以 5000 g 离心 l0mim, 使水相和有机相分开。

        5) 将上层水相移至另一离心管内. 按步骤 4 用酚:氯仿(1:1) 再抽提 1 次。

        6) 将水相移至为-管内,加 0.1 体积 3mol/L 乙酸钠 (PH5.2),混匀,加 2.5 倍体积冰预冷的乙醇,冰浴 2 h

        7) 于 4°C 以 5000 g 离心 l5 min,小心去除上淸液,室温晾下 RNA 沉淀. 少量水溶解RNA, 加 3 倍体积乙酔,于—70℃ 储存备用.如要除去糖蛋白和卵黄物质,则可根据需要逬行步骤 8)〜11)

        8) 用少量水重溶 RNA 沉淀,加等体积经髙压灭菌的 8mol/L 氯化锂,混匀,一 20℃放置 3 h 以上。

        9) 于 4℃ 以 10000 g 离心 30 min 沉淀 RNA, 小心弃上清。

        10) 用 70% 乙醇洗涤沉淀,离心片刻,弃去上清液. 于空气中晾干核酸沉淀。

        11) 用少量水重溶 RNA, 加 3 倍体积乙醇,于 一 70℃ 储存备用。

        注意事项

        1) 用氯化锂沉淀 RNA 从而有助于去除糖蛋白和卵黄物质

        2) 由于此方法分离的 RNA 量大超过污染的 DNA 量,因此不必除去制品中的 DNA。尽管污染的基因组 DNA 序列不干扰杂交和翻译,但如果此 RNA 用于构建 cDNA 文库,则这些 DNA 可能会引起混乱,在这种情况下吋用无 RNA 酶的胰 DNaseI 进行消化,以去除污染的 DNA

        来源:丁香实验

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