• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        氯化铯/溴化乙锭平衡离心法

        最新修订时间:

        原理

        这种方法可以得到除去了大多数杂质的高纯度质粒DNA。但它需要使用溴化乙锭,并且需要长时间的超速离心来形成密度梯度。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  粗裂解物制备方案最后一步得到的沉淀溶于4 ml TE缓冲液中,加人4.4 g CsCl,溶解后,再加人0.4 ml 10 mg/ml溴化乙锭。如果用的是上清(也就是来自于备选方案),按上清的体积依比例扩大CsCl和溴化乙锭。
         
        2.  将溶液转人一个5 ml的quick-seal快速封口的超离心管中,往管中加人1 g/ml CsCl/TE溶液,封好离心管。

        3.  于 20°C,500000 g 离心3.5 h 或于 20 °C,以 350000 g 离心14 h 以上。

        4.  小心地取出管子,从管的顶端插入一支20-G针头,然后用带另一 20-G针头的3 ml注射器将质粒带吸出(针头插入质粒带下约1 cm)。

        5.  为了得到更高纯度的质粒DNA,在新管中进行第二次超速离心,管顶加有含0.1 mg/ml溴化乙锭的CsCl/TE缓冲液。

        6.  按质粒DNA/EB溶液的1.5~2 倍体积装Dower AG50W-X8 柱子, 用数倍体积的TE/0.2 mol/L NaCl溶液清洗和平衡柱子。

        7.  用注射器将混合有溴化乙锭的质粒DNA溶液直接加到树脂的顶部,注意不要摇动树脂。立即收集流出液。

        8.  用2倍于上样质粒溶液体积的0.2 mol/L NaCl/TE溶液洗脱柱子两次,用同一管子收集流出液。
         
        也可以用等体积TE饱和的正丁醇来除去溴化乙锭。充分涡旋振荡混匀,然后除去有机相,重复几次直至在紫外灯下看不见红色,然后加人3倍体积TE缓冲液来稀释氯化铯,在本方法中产生的含有溴化乙锭的有机废物应该妥善处理。

        9.  加入2倍体积100%乙醇于室温或-20°C沉淀质粒DNA。于4°C,以10000 g离心10 min。沉淀DNA时温度不要低-20°C,以免氯化铯沉淀下来。

        10.  沉淀用70%乙醇洗1遍,真空干燥,溶解于TE缓冲液,并于4°C保存。

        注意事项

        1.  溴化乙锭是一种诱变剂并能造成环境污染,操作时应戴手套,并且妥善处理。

        2.  必须在温度不低于15°C下离心,这是为了防止对转子和离心机的损坏以及潜在的严重的人员伤害。

        3.  为了防止紫外线对眼睛的严重损伤,应戴紫外防护眼镜或面罩。操作溴化乙锭时要戴手套。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序