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        基因置换技术

        相关实验:克隆化酵母DNA的操作实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料

        步骤

        一、整合性破坏

        1.  将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。

        2.  在此内部片段中将质粒线性化。

        3.  继续整合性转化步骤3(见基本方案1)。

        二、基因破坏一步法

        1.  将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上,必要时,可在亚克隆的同时引入一个缺失。

        2.  采用合适的限制性位点,从步骤1抅建的质粒中切出含有被破坏基因的片段,凝胶电泳纯化。用1~10 μg 凝胶纯化片段进行转化并选择插入标记。
         
        3.  Southern 杂交法确证破坏结果。如果转化二倍体,产生孢子后经剖分以获得带有被破坏基因的单倍体孢子。

        三、转移

        1.  将目的基因亚克隆到YIp5,诱变质粒或者引入确定的缺失或插入突变。
         
        2.  从质粒的线性化开始,按整合性转化方案进行(基本方案1)。
         
        3.  将转化子在非选择性液体培养基(YPD或含尿嘧啶的极限培养基)中培养过夜,然后在非选择性培养基平板上30℃培养两天使长出克隆(约100单克隆)。
         
        4.  将平板影印至5-FOA平板上培养过夜以鉴别Ura- 分离子,在液体培养基培养期间丟失了质粒的菌落在5-FOA平板上具有完全的抗性,这些克隆可以通过非选择性平板回收,并用于步骤5。其他在克隆生长期间丢失了质粒的菌落在5-FOA影印平板上将出现乳头状突起。

        5.  通过突变表型筛选5-FOA菌落,如果突变体的限制酶切图谱与野生型基因相比有预期的改变,用Southern 杂交法确证突变菌落的基因型。

        来源:丁香实验

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