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        克隆化酵母DNA的操作实验

        实验分类:

        微生物实验

        最新修订时间:

        简介

        尽管整合性转化的频率很低,但可以通过与整合位点同源的克隆化基因内的限制性位点将质粒线性化以提高转化效率。得到的整合体含有完整的质粒,两侧为基因的完整拷贝。

        来源:丁香实验

        操作方法

        基本方案1(整合性转化)

        1. 将待研究的基因亚克隆到YIP质粒。 2. 用限制性内切酶在克隆化基因内部切开,使质粒线性化。 3. 用1~10 μg DNA加上担体DNA转化适合的菌株,通过质粒上带的标记进行选择,在选择培养基上纯化几个转化子,制备DNA,应用Southern 杂交确证整合是否发生在所期望的位点,并且测定是否发生了多重整合。

        基因置换技术

        一、整合性破坏 1. 将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。 2. 在此内部片段中将质粒线性化。 3. 继续整合性转化步骤3(见基本方案1)。 二、基因破坏一步法 1. 将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上,必要时,可在亚克隆的同时引入一个缺失。 2. 采用合适的限制性位点,从步骤1抅建的质粒中切出含有被破坏基因的片段,凝胶电泳纯化。用1~10 μg 凝胶纯化片段进行转化并

        基本方案(质粒缺口修复)

        1. 将目的基因亚克隆到YRp质粒,通过基因内的两个限制性位点在基因中创造一个缺口区,在缺口两侧留下≥100~250 bp 的同源区,凝胶电泳纯化质粒骨架大片段。 2. 用1~10 μg缺口质粒DNA转化待拯救的含突变等位基因的酵母菌株,通过YRp质粒上的选择基因进行选择,应用质粒分离除去技术鉴定选择标志不稳定的转化子。 3. 在不稳定的转化子中,筛选那些仍然显示突变表型的

        基本方案(穿梭质粒)

        1. 构建其必需基因的染色体拷贝已被破坏的单倍体菌株,及带有完整的必需基因和URA3选择标志的YEp质粒。 2. 将必需基因亚克隆到YCp载体(带有URA3以外的选择标志),取约10~20 μg 用羟胺或其他技术进行诱变。 3. 转化至步骤1的菌株中,在添加了尿嘧啶的省却成分平极上,选择YCp质粒,于允许温度下培养(通常为25℃)。 4. 将每一个转化平板影印到两个带有5-F

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