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        甲硫氨酸短时间标记悬液中的细胞

        相关实验:蛋白质的生物合成标记实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  培养悬浮细胞至对数增长期,室温300 g 离心5 min。回收107~108细胞。
         
        2.  每2×107细胞用约10 ml 37℃的短时间标记培养基在圆锥型试管中洗涤,于室温300 g 离心5 min 回收细胞,小心重悬细胞并重复洗涤过程。

        3.  以37℃的短时间标记培养基重悬至5×106细胞/ml,于37℃保温15 min 以耗尽细胞内的甲硫氮酸,间歇摇动。

        4.  室温解冻[35S]甲硫氨酸,并用37℃短时间标记培养基来配制含0.1~0.2 mCi/ml 的工作液。
         
        5.  室温300 g 离心5 min,回收细胞,每2×107细胞以4 ml[35S]工作液重悬于圆锥试管。37℃水浴保温30 min~3 h,频繁翻覆试管以混悬细胞。

        6.  4℃ 300 g 离心回收细胞,小心重悬于10 min 冰冷PBS缓冲液,重复离心操作。

        7.  必要时,用TCA沉淀法确定放射性标记的掺入量,按免疫亲和层析、免疫沉淀法和单向和双向凝胶电泳处理和分析细胞。

        注意事项

        1.  在标记过程,会释放挥发性的[35S]化合物,在使用前须把过于37℃水浴的[35S]甲硫氨酸紧紧密封,不要在37℃放置超过30 min。

        2.  培养液和冼涤液具放射性,须遵循放射性物质的使用和丢弃的安全守则进行。

        来源:丁香实验

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