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        快速法(琼脂扩散法)

        相关实验:非标记抗体免疫电镜实验

        最新修订时间:

        原理

        标记抗体法虽然具有许多优点,但也存在一些难以克服的问题,如标记抗体的分子增大,对细胞膜和组织的穿透力减弱;化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响;结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合,影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素,通过一系统的非标记抗体的免疫学反应,对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。前者利用基因工程方法制备双特异性抗体的F(ab')2,一个Fab片段与标本中的抗原结合,一个Fab是抗体蛋白的结合片段。在抗体与标本作用后,再加入铁蛋白与抗体结合,从而显示组织内抗原的所在部位。后者则用磷酸钨负染后,直接电镜观察。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料及试剂
         
        1.  待检病毒材料  如粪便,气管分泌物、脑脊髓液、组织培养液等。
         
        2.  高速离心机
         
        3.  已知抗体
         
        4.  磷钨酸
         
        5.  琼脂糖
         
        6.  其它
         
        二、操作方法
         
        1.   制备免疫复合物。
         
        2.   以生理盐水或pH7.2巴比妥缓冲液制备1%琼脂糖,趁热浇注于洁净的载玻片上,每片3ml,待冷却凝固后,在凝胶面上等距离放置直径4 mm玻璃珠数粒,再于凝胶面上浇注1%琼脂糖2 ml~3 ml,冷却凝固后,取出玻璃珠,使凝胶形成凹孔。
         
        3.   将普通滤纸剪成2x3 cm大小,3~4层重叠。用小刀将带有凹孔的琼脂糖切成小块,每块带有一个凹孔,平放在滤纸上。
         
        4.   在凹孔内,加入制备好的含病毒的免疫复合物悬液。
         
        5.   将电镜载网的Fomnvar膜面向下倒悬于液滴上。由于琼脂糖的吸水作用,20 min~30 min后,可将液滴的水分吸干,而浓缩的免疫复合物则粘附在载网膜上。
         
        6.   在载网膜上滴加3%磷钨酸负染20 s,过量的负染液用滤纸在载网边缘轻轻吸去。
         
        7.   于透射电镜4x104倍下观察。
         
        三、结果判定
         
        直接观察病毒粒子的形态。由于离心浓缩的处理和特异性抗体的加入,大大提高了观察的敏感性。

        来源:丁香实验

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