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        质体快速检定法

        互联网

        2417

        这个方法是以phenol 及chloroform 溶菌后直接进行电泳分析,并未将质体DNA与宿主细菌染色体DNA 分离,得到的DNA 也不能用限制酶作用。但因其快速简便,所以可藉的于短时间内检定大量转形株中质体DNA 的相对分子量,以初步筛选带有重组质体的转形株。

        药品试剂:

        LB/Amp plates (LB plate 添加100 μg/mL ampicillin)

        1×NET (20 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 0.1 mM EDTA, pH 8.0)

        PCI (25:24:1)

        RNase A (1 mg/mL)

        1% agarose gel

        方法步骤:

        1) 由前一天转形所得的转形株中,挑选12~24 个单一菌落,在LB/Amp plate上划数道短的横线或斜线,同时也须要接种带有载体pQE31 的菌株,于37℃培养过夜或直至菌体长出。

        2) 以接种环将菌体刮下,悬浊在30 μL 1×NET 中,震荡混合均匀。

        ◆ 不要忘了pQE31/JM109!

        3) 加入30 μL PCI,剧烈震荡。

        4) 以12,000 rpm 离心3 min (室温)。

        5) 将上层液吸至另一支干净离心管,加1 μL RNase A 及3 μL 10×追踪染剂,以50 V 进行电泳分析。 由于样品中有细菌染色体DNA,所以在加入样品槽时需十分小心,否则DNA 极易流失在电泳缓冲液中。 电泳后,可由质体DNA 的泳动率知其相对分子量大小。

        6) 选取带有质体分子量大于pQE31 的菌落,接种于3 mL LB/Amp 液体培养基,于37℃震荡培养过夜,以抽取质体,进行限制酶分析。

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