材料与仪器
步骤
1. 对应于毎个待测模板，分别以A、G、C、T 标记好4个微量离心管。
2. 分别往标好A、G、C、T 的管子中，加A、G、C、T 测序混合液各3 μl。
2. 分别往标好A、G、C、T 的管子中，加A、G、C、T 测序混合液各3 μl。
3. 对于单链模板：在0.5 ml 微量离心管中混匀下列试剂
（1）0.04 pmol 单链DNA模板
（2）0.6 pmol 引物
（3）1.5 μl 10×VentR（exo-）测序缓冲液
（4）1 μl 3%Triton X-100
（5）加水至12 μl
（6）用吸管上下抽吸轻轻混匀溶液。
4. 对于双链DNA模板： 在0.5 ml 微量离心管中混匀下列试剂
（1）0.1 pmol 双链DNA模板
（2）1.2 pmol 引物
（3）1.5 μl 10×VentR（exo-）测序缓冲液
（4）1 μl 3%Triton X-100
（5）加水至12 μl
（6）通过用吸管上下抽吸，使溶液混匀。
5. 毎个模板/引物混合物加1~2 μl 10 mCi/ml［α-35S］dNATP、［α-32P］dNATP或［α-32P］dNATP，用吸管轻轻上下抽吸混合溶液。
6. 经步骤5操作后的管子，加入1 μl 2 000 U/ml 的VentR（exo-）DNA聚合酶。
（1）0.04 pmol 单链DNA模板
（2）0.6 pmol 引物
（3）1.5 μl 10×VentR（exo-）测序缓冲液
（4）1 μl 3%Triton X-100
（5）加水至12 μl
（6）用吸管上下抽吸轻轻混匀溶液。
4. 对于双链DNA模板： 在0.5 ml 微量离心管中混匀下列试剂
（1）0.1 pmol 双链DNA模板
（2）1.2 pmol 引物
（3）1.5 μl 10×VentR（exo-）测序缓冲液
（4）1 μl 3%Triton X-100
（5）加水至12 μl
（6）通过用吸管上下抽吸，使溶液混匀。
5. 毎个模板/引物混合物加1~2 μl 10 mCi/ml［α-35S］dNATP、［α-32P］dNATP或［α-32P］dNATP，用吸管轻轻上下抽吸混合溶液。
6. 经步骤5操作后的管子，加入1 μl 2 000 U/ml 的VentR（exo-）DNA聚合酶。
7. 立即往步骤2的含VentR（exo-）测序混合物A的管子中加入3.2 μl 步骤5操作后所得的混合物。
8. 分别重复此过程于C、G、T管，每次均换吸头，反应混合物，置于冰上。
9. 往每个反应混合物上滴入1滴无菌矿物油。
10. 在热循环反应装置中设定如下反应条件：20循环：20 s，90℃；20 s，55℃；20 s，72℃反应管放入热循环仪中，启动程序。
11. 在矿物油层下加入4 μl TCS终止/加样染料。
8. 分别重复此过程于C、G、T管，每次均换吸头，反应混合物，置于冰上。
9. 往每个反应混合物上滴入1滴无菌矿物油。
10. 在热循环反应装置中设定如下反应条件：20循环：20 s，90℃；20 s，55℃；20 s，72℃反应管放入热循环仪中，启动程序。
11. 在矿物油层下加入4 μl TCS终止/加样染料。
12. 样品在85℃温育3 min。
13. 将吸管头插入覆盖矿物油层下面的反应物中，取2 μl 加样于测序胶进行电泳，并读出序列。
13. 将吸管头插入覆盖矿物油层下面的反应物中，取2 μl 加样于测序胶进行电泳，并读出序列。
来源：丁香实验
