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        人类外周血染色体制备

        相关实验:人类外周血染色体制备

        最新修订时间:

        原理

        人的外周血淋巴细胞培养疗法是1960年由Moorhead提出来的。正常情况下,人外周血小淋巴细胞都处在G1期(或G0期)。但在体外给予一-定的条件,进行培养,经72h就可获得大量的有丝分裂细胞。这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。


        在培养液中加入植物血凝素(PHA),淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞,进入有丝分裂短期培养后,经秋水仙素处理,可抑制细胞分裂时纺锤丝的形成,使细胞分裂停止在中期.同时它可改变细胞质的黏度,引起染色体在细胞质中分散。经低渗和固定,即可得到大量的、分散效果好的染色体分裂象。人体的1mL外周血中一般含有约(1~3)×106个小淋巴细胞,足够染色体标本制备和分析之用。

        材料与仪器

        步骤

        一、试剂配制


        1. 培养基的配制:

        RPMI 1640培养基        4ml

        小牛血清                     1ml

        青霉素和链霉素    各100U/ml

        PHA                          0.2ml

        肝素                         1小滴

        以5% NaHCO3调pH至7.2~7.4。4℃备用。


        2. 肝素:称取0.2g溶于100ml双蒸水中,浓度为0.2%,灭菌。


        3. 秋水仙素:生理盐水配制成20μg/ml浓度,灭菌,分装,置-20℃。


        4. 低渗液:0.075 mol/L KCI


        5. 固定液:甲醇:冰乙酸(3:1),临时配制。


        6. Giemsa工作液:1份原液和9份磷酸缓冲液,临时配制。


        7. 磷酸缓冲液:1/15mol/L Na2HP4、1/15 mol/L KH2PO4等体积混合。


        8. 5%NaHCO3火菌滤器抽滤备用。


        二、实验步骤


        1. 接种,培养


        (1)在无菌条件下,用灭菌注射器吸取0.2%肝素液(用生理盐水配制,灭菌)0.2ml,湿润针筒后,采静脉血1~2ml、转动注射器使血液与肝素充分混匀。


        (2)无菌条件下,将肝素化血液滴入至外周血培养基内,每5ml培养液内滴入血滴28~30滴(7号针头)轻轻混匀。


        (3)置37℃恒温箱内,静止培养68~72h。注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象,可每天将培养液摇一摇以便细胞得到充分培养。


        (4)终止培养前2~3h,加入浓度为20μg/ml的秋水仙素,每5ml培养基中用7号针头,加3~4滴使最终浓度为0.1μg/ml。轻轻摇匀后,再放入恒温箱内,继续培养2~3h,以积累较多停止在中期的分裂象。


        2. 制片


        (1)收获细胞:由恒温箱取出培养瓶,用吸管充分吹打培养瓶瓶壁,使细胞全部脱离瓶壁,然后将细胞液移至锥形离心管内,1500转/min,离心10min,去上清液。


        (2)低渗处理:加入37℃预温的0.075mol/L KCl 8ml,反复吹打(约一百次)后,置37℃水浴箱中低渗处理25min左右。


        (3)预固定:加入新鲜制备固定液1ml(甲醇:冰醋酸=3:1),轻轻混匀。


        (4)离心:2000转/min,离心10min,吸弃上清液。


        (5)固定:沿离心管壁慢慢加入固定液8ml,轻轻混匀,制成细胞悬液。

         

        (6)离心:同上,吸去上清液。


        (7)再固定:加固定液8ml,混匀,固定10mn。


        (8)离心:同上,吸去上清液。。


        (9)制细胞悬液:根据细胞量多少,加入适量固定液,充分混匀,制成细胞悬液。


        (10)滴片:取出预先经冰水浸泡的载玻片,用吸管吸取混匀的细胞悬液在离冰片约30cm距离进行滴片,每片约滴2~3滴细胞悬液,使细胞较好分散。一般每一培养瓶可制3~5张标本片。


        (11)染色:标本晾下后,即可用染液(Giemsa液原液1份,pH6.8的磷酸缓冲液9份)染色15min,自来水冲洗后(从背面冲洗)晾干。


        3. 镜检:人类每个体细胞有46条染色体,根据染色体的长度和着丝粒位置的不同,可以分成22对常染色体和一对性染色体,男子是是46,XY;女子是46,XX。

        注意事项

        1. 秋水仙素处理时间过长,分裂细胞多,染色体短小;反之,则少而细长,故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。


        2. 固定液应在使用前临时配制。


        3. 载玻片一定要洁净,否则染色体分散不好。

            

        4. 染色体分裂指数低:患者处于非常时期(放、化疗期);培养基营养成分不良;培养基pH偏低或偏离;PHA过量或不足;小牛血清质量不高;培养箱温度偏低;秋水仙素处理时间过短。


        5. 接种的血样愈新鲜愈好。

            

        6. 培养过程中,如发现血样凝集,可将培养瓶轻轻振荡,使凝块散开,继续放回37℃恒温箱内培养。

        常见问题

        来源《实验基础医学》第3版

        来源:丁香实验

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