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- 2025年07月16日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
100
- 英文名：
Aniline-4 Hydroxylase (AH) Test Kit
- CAS号：
无
- 保质期：
1年
- 供应商：
上海晅科生物科技有限公司
- 保存条件：
2-8℃
- 规格：
50管/24样
苯胺-4-羟化酶（AH）活性测定试剂盒说明书
微量法 100 管/48 样
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。测定意义：
细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。AH 在 P450 酶系中相当于 CYP2E1 亚型，CYP2E1 不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。测定原理：
AH 催化苯胺羟化后产生的 4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在 630nm 处有特征吸收峰；通过测定 630nm 吸光度增加速率，来计算 AH 活性。自备仪器及用品：
普通离心机、超速离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、双蒸水和冰。试剂组成和配制：
试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 100mL 蒸馏水，充分溶解。试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 10mL 蒸馏水，充分溶解。试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水，充分溶解。试剂五：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂×1 瓶（腐蚀性试剂），4℃避光保存。临用前加入 10mL 蒸馏水，充分溶解。试剂七：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 10mL 蒸馏水充分溶解。
标准液：液体×1 瓶，100μmol/L，4℃避光保存。
粗酶液提取：
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约 0.5g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃，离心 30min，取上清液，转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体： 100 000g 4℃，离心 60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g
离心 30min，弃上清液。
4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。
测定操作：
- 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 630 nm，蒸馏水调零。
- 试剂三置于 37℃水浴中预热 30min。
- 试剂五置于冰浴预冷 30min。
- 标准管：取 0.5 mL EP 管，加入 100μL 标准液，100μL 试剂六，100μL 试剂七，混匀后室温静置 30min，吸取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 测定光吸收，记为 A 标准管。
- 对照管：取 0.5 mL EP 管，加入 50μL 粗酶液，100μL 试剂三，50μL 蒸馏水，混匀后 37℃ 水浴中保温 30min；再加入 100μL 试剂五，混匀后冰浴 5min，11000rpm，4℃，离心 10min； 取 100μL 上清液，加入新的 0.5 mL EP 管；再加入 100μL 试剂六，100μL 试剂七，混匀后室温静置 30min，吸取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 测定光吸收，记为 A 对照管。
- 测定管：取 0.5 mL EP 管，加入 50μL 粗酶液，100μL 试剂三，50μL 试剂四，混匀后 37℃ 水浴中保温 30min；再加入 100μL 试剂五，混匀后冰浴 5min，11000rpm，4℃，离心 10min； 取 100μL 上清液，加入新的 0.5 mL EP 管；再加入 100μL 试剂六，100μL 试剂七，混匀后室
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AH 活性计算公式：
- 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
- 按蛋白浓度计算
AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释
倍数÷（Cpr×V 样）÷T
= 40×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr 。
- 按样本质量计算
AH 活性(nmol/min/g 鲜重)= C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V 样)÷T
= 40×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W
C 标准品：100μmol/L；V 标准品：100μL=1×10-4L；稀释倍数： V 反总÷V 样=300μL÷ 50μL=6；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；V 样：加入反应体系中粗酶液体积，50μL=0.05 mL；W ：样品质量； T： 催化反应时间（min），30min。
- 使用 96 孔板测定的计算公式如下
- 按蛋白浓度计算
AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释
倍数÷（Cpr×V 样）÷T
= 40×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr
- 按样本质量计算
AH 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V 样)÷T
= 40×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W
C 标准品：100μmol/L；V 标准品：100μL=1×10-4L；稀释倍数：V 反总÷V 样=300μL÷50μL=6； Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；V 样：加入反应体系中粗酶液体积，50μL=0.05 mL；W ：样品质量； T：催化反应时间（min），30min。
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文献和实验相关实验
亦称为氢氧化酶，是加氧酶的一种，是催化利用氧分子形成氢氧化物（酚、醇）反应的酶。所谓单（加）氧酶，除底物外，还需要电子供体（ NADP-H） AH O2 NADPH H → AOH NADP H2 O 在从苯丙氨酸合成酪氨酸，（苯丙氨酸羟化酶），从苯胺合成氨基苯酚（芳基 -4-羟化酶）。从鲨烯（三十碳六烯 squalene）合成类固醇（鲨烯羟化酶）以及进行类固醇的羟基化（各种类固醇羟化酶）等的反应中，都存在着羟化酶。在羟化酶中，多数以 P-450
水解，生成新的甘油，达到新的平衡，因此样品与R1试剂孵育时间越长，测得甘油三酯值就越低。甘油三酯测定，不仅要去除游离甘油，而且还要克服样本含量真实性发生的变化，试剂中必须加入甘油激酶，并且延迟时间要标准化。所以，一些试验项目在消除内源性物质干扰的同时，会带来样品含量真实性的变化。 参考文献 [1]韩志钧，黄志锋，卢业成，主编．临床化学常用项目自动分析法[M]．沈阳：辽宁科学技术出版社，2005．29—112． [2]张万忠．临床生化试剂盒质量评估方法[J]．上海
技术资料苯胺-4羟化酶（AH）生化试剂盒
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