上海钙蛋白(OCN)ELISA检测实验

一、实验原理

OCN ELISA检测基于双抗体夹心法，具体流程如下：

1. 包被抗体：将特异性抗OCN抗体预先固定在微孔板表面，形成固相抗体。
2. 抗原结合：加入待测样本或标准品，OCN与固相抗体结合形成复合物。
3. 酶标抗体结合：加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，形成“抗体-抗原-酶标抗体”夹心结构。
4. 显色反应：加入底物TMB，在HRP催化下显蓝色，终止液（如硫酸）终止反应后变为黄色。颜色深浅与OCN浓度呈正相关。
5. 定量分析：通过酶标仪在450 nm波长下检测吸光度（OD值），结合标准曲线计算样本浓度。

二、标准操作流程

1. 试剂准备

   • 洗涤液：将浓缩液（20×）按1:20稀释（如30 mL浓缩液+570 mL蒸馏水）。
   • HRP标记抗体：按说明书稀释（如1:100）并避光保存。
   • 显色液（TMB A/B）和终止液需现用现配，避光保存。

2. 样本处理

   • 血清/血浆：室温凝固10-20分钟（血清）或加入抗凝剂（血浆），2000-3000 rpm离心20分钟，取上清；避免反复冻融。
   • 尿液/脑脊液：直接离心后取上清，若保存中沉淀需再次离心。
   • 组织匀浆：称重后加入PBS匀浆，离心取上清；植物组织需液氮研磨。
   • 细胞培养上清：检测分泌型OCN时直接离心；检测胞内OCN需反复冻融或超声破碎细胞。

3. 实验步骤

   • 加样：标准品孔加梯度浓度标准品50 μL，样本孔加10 μL样本+40 μL稀释液。
   • 孵育：37℃孵育60分钟，彻底洗涤5次（手工或洗板机）。
   • 显色与终止：每孔加底物A/B各50 μL，避光显色15分钟，加终止液后15分钟内测OD值。
   • 结果计算：以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，计算样本浓度。

三、试剂配制与保存

• 洗涤液：若出现结晶，37℃加热溶解后稀释。
• HRP抗体：使用前瞬时离心，按比例稀释后避免反复冻融。
• 保存条件：试剂盒通常需2-8℃保存，开封后剩余板条密封冷藏；标准品分装后-20℃保存