Trap-elisa检测实验

一、定义与原理

Trap-ELISA（抗酒石酸酸性磷酸酶酶联免疫吸附试验）是一种基于抗原-抗体特异性结合的高灵敏度检测技术，主要用于定量检测生物样本中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）或端粒酶活性。根据应用场景不同，分为两类：

1. TRAP浓度检测：通过双抗原夹心法（或双抗体夹心法）测定血清、血浆、组织匀浆等样本中的TRAP水平。
2. 端粒酶活性检测：结合端粒重复扩增法（TRAP）与PCR-ELISA技术，定量检测端粒酶活性，适用于肿瘤研究。

核心原理：

1. TRAP浓度检测：
   • 将纯化的TRAP抗原包被微孔板形成固相抗原；
   • 加入样本中的TRAP抗体和HRP标记的抗原，形成“抗原-抗体-酶标抗原”复合物；
   • 洗涤后加入TMB底物显色，颜色深浅与TRAP浓度正相关，通过酶标仪（450nm）测定吸光度（OD值），绘制标准曲线计算浓度。
2. 端粒酶活性检测：
   • 利用端粒酶延伸端粒重复序列的特性，结合PCR扩增；
   • 扩增产物通过ELISA系统（如生物素-链霉亲和素结合）检测，避免放射性同位素标记。

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二、实验操作步骤（以TRAP浓度检测为例）

1. 实验准备：

• 试剂盒组成：包括微孔板、标准品、HRP标记检测抗体、洗涤液、显色剂（A/B液）、终止液等。
• 设备需求：酶标仪、恒温箱、离心机、微量移液器及枪头。
• 样本处理：
  • 液体样本（血清/血浆）：离心（2000-3000rpm, 20分钟）后取上清，避免溶血。
  • 组织样本：匀浆后离心取上清，必要时添加蛋白酶抑制剂。
  • 细胞培养上清：直接离心收集。

2. 标准品稀释：

• 原倍标准品按梯度稀释（如1:2至1:32），用于建立标准曲线。

3. 加样与温育：

• 设置空白孔、标准孔和样本孔；
• 标准孔加50μl标准品，样本孔加40μl稀释液+10μl样本（终稀释度5倍）；
• 加入HRP标记抗体，37℃温育30-60分钟。

4. 洗涤：

• 使用稀释后的洗涤液（如30倍浓缩液），每孔加满后静置30秒，重复洗涤5次，拍干。

5. 显色与终止：

• 每孔依次加入显色剂A/B各50μl，避光显色15分钟；
• 加入终止液50μl，蓝色立即转为黄色。

6. 测定与计算：

• 15分钟内用酶标仪测定450nm处OD值；
• 以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制曲线，计算样本浓度。

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三、关键注意事项

1. 加样准确性：使用校准后的移液器，避免气泡，单次加样控制在5分钟内。
2. 温育条件：严格控温37℃，避免震动影响结合效率。
3. 洗涤彻底性：残留液体会导致背景值升高，影响灵敏度。
4. 样本稀释：若样本OD值超出标准曲线范围，需用稀释液进一步稀释后复测。
5. 质量控制：每批次实验需同时检测标准曲线，建议做复孔以减少误差。