转基因构建OTP增强子-CrylA基因探针法qPCR试剂盒

转基因构建OTP增强子-CrylA基因探针法qPCR试剂盒产品特点:
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强
样品RNA的抽提：
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测
1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。
样品cDNA合成:
①反应体系
序号  反应物  剂量 1  逆转录buffer  2μl
2  上游引物  0.2μl
3  下游引物  0.2μl
4 dNTP  0.1μl
5  逆转录酶MMLV  0.5μl
6  DEPC水  5μl
7  RNA模版  2μl
8  总体积  10μl
环一螺旋蛋白1抗体        
肿瘤转移抑制基因H4抗体        
神经元衍生孤儿受体1抗体        
轴突生长诱向因子4抗体        
脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白4抗体        
细胞核因子/k基因结合核因子 p52/p100抗体        
线粒体复合物NDUFS7蛋白抗体        
尼曼匹克C2前体蛋白抗体        
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸酶1抗体        
合成酶-1抗体        
转录因子相关蛋白NKX6.1抗体        
造血蛋白1抗体        
骨巢蛋白抗体        
NUP54抗体        
亲核素β1抗体        
谷氨酸受体NMDAζ1抗体        
谷氨酸受体NMDAζ2抗体        
神经元素2抗体        
抑癌基因NDRG3抗体        
有丝分裂氧化酶1抗体        
NADPH oxidase 3抗体        
NADPH氧化酶NOX家族的成员4抗体        
细胞分裂周期相关蛋白1抗体        
NFAM1抗体        
环指蛋白67抗体        
神经母细胞瘤抑瘤蛋白1抗体        
嗜中性粒细胞胞浆因子1抗体        
线粒体复合物NDUFS3蛋白抗体        
雄激素受体复合物相关蛋白/核受体相互作用蛋白抗体        
9号染色体开放阅读框156抗体        
核因子活化T细胞胞浆蛋白3抗体        
干细胞转录因子NANOGP8抗体        
神经细胞凋亡抑制蛋白抗体        
肾病样蛋白2抗体        
SNF1/AMP激酶相关激酶2抗体        
鸡新城疫疫苗抗体        
神经外营养蛋白1抗体        
神经源性神经营养因子抗体        
神经内分泌转化酶2抗体        
神经肽W抗体        
神经肽Y受体5抗体        
转基因构建OTP增强子-CrylA基因探针法qPCR试剂盒神经肽Y受体4抗体        
螺旋环螺旋蛋白1+2抗体        
胚胎神经细胞NNAT抗体        
NUDCD3蛋白抗体        
CD244自然杀伤细胞受体2B4抗体        轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

实验步骤：
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。