上海肿瘤细胞CCK8实验

一、CCK8实验的基本原理与目的

1. 原理
   CCK8（Cell Counting Kit-8）是一种基于水溶性四唑盐（WST-8）的细胞增殖与毒性检测方法。活细胞中的脱氢酶可将WST-8还原为橙黄色甲臜（formazan），其生成量与细胞活力和数量呈正相关。通过酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），可间接反映细胞代谢活性。

   • 优势：灵敏度高、操作简便（无需洗涤细胞）、毒性低，适用于悬浮细胞与贴壁细胞。
   • 应用：肿瘤药敏试验、药物筛选、细胞增殖/毒性测定、微生物与细胞互作研究。

2. 实验目的

   • 评估肿瘤细胞在不同处理（如药物、基因调控）下的增殖或抑制效果。
   • 筛选抗肿瘤药物并计算半数抑制浓度（IC50）。

二、实验所需试剂与仪器

1. 试剂与材料

   • 细胞系：常用肿瘤细胞如U87胶质瘤细胞（需处于对数生长期）。
   • 试剂：CCK8试剂（避光保存于-20℃或4℃，避免反复冻融）、培养基、胎牛血清、胰酶、PBS缓冲液。
   • 耗材：96孔板（边缘孔加PBS减少蒸发干扰）。

2. 仪器

   • 酶标仪（检测波长450 nm，参考波长600-650 nm）。
   • CO₂培养箱、超净工作台、离心机。

三、实验操作步骤

1. 细胞接种与处理

   • 接种密度：贴壁细胞推荐1000-10000个/孔（毒性实验需更高密度），悬浮细胞≥2500个/孔。
   • 分组设置：实验组、对照组（不加处理）、空白组（无细胞）。
   • 药物处理：梯度稀释药物后加入细胞，培养6-96小时（根据药物性质调整）。

2. CCK8试剂添加与孵育

   • 每孔加入培养基体积10%的CCK8试剂（如100 μL培养基加10 μL试剂），避免气泡产生。
   • 孵育1-4小时（贴壁细胞通常1小时，悬浮细胞需延长至5-6小时），每30分钟监测OD值至1.0-2.0。

3. 终止与检测

   • 加入SDS或HCl终止反应（可选），立即用酶标仪测定450 nm吸光度。

四、数据分析方法

1. 数据预处理
   • 扣除空白组OD值（背景干扰），排除含酚红培养基或药物的影响。
   • 公式：

• 细胞存活率 = [(实验组OD - 空白OD) / (对照组OD - 空白OD)] × 100%。
• 抑制率 = 100% - 存活率。

1. 统计与可视化
   • 使用GraphPad Prism或Excel进行t检验、方差分析（ANOVA），绘制生长曲线或柱状图。
   • 计算IC50：通过非线性回归拟合剂量-效应曲线。