细胞Transwell检测服务

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细胞Transwell检测技术服务是达为科生物的基础服务项目之一，由细胞平台经验丰富的实验人员操作完成。

细胞迁移运动普遍存在于组织发育、伤口愈合、血管发生等许多正常的生理过程中, 同时又存在于像肿瘤发生这样的病理过程中。很多情况下,细胞迁移运动并不是随机和无目的的, 而是受到趋化因子的触发和诱导，在趋化因子出现后, 它通过与细胞表面受体的相互作用,诱导出各种细胞内的应答,如细胞极化产生、骨架重排、小泡运输加快等, 这些应答反应最终协助细胞完成迁移运动。

细胞迁移运动过程主要包含以下四个循环步骤: ①在细胞迁移的前导端, 局部细胞膜出现前伸而形成伪足; ②伪足通过黏附结构黏附到基底; ③细胞骨架收缩, 引起细胞位置的整体易位; ④尾端脱黏附及回缩。通过以上步骤循环进行, 细胞将一步步向目的地前行。细胞黏附、迁移和极化的保持等过程都依赖于整合素的靶向作用及其所包含黏附位点的重组动力, 也即在细胞前端的胞吐作用能够为细胞提供新的黏附受体来辅助细胞迁移,同时这些运动的受体在细胞的尾部通过胞吞内化, 故由此形成以胞吞和胞吐为调节方式的整合素循环。

肿瘤细胞骨架发育缺陷和黏附分子表达异常必然引起其运动迁移行为发生改变,其中比较明显的变化涉及三个方面: ①细胞连结普遍削弱, 导致以细胞间连结发达的上皮类组织细胞突变转化后出现细胞随机迁徙, 引起组织解体的现象; ②细胞与基底黏附失调,由于整合素表达与基质金属蛋白酶分泌异常,导致细胞黏附不稳和脱黏附现象;③肿瘤细胞普遍软化(刚度大约比正常细胞低4倍), 使其黏附的基质环境硬度相对增大, 导致细胞内张力增加, 从而有利其迁移运动。肿瘤细胞的迁移运动行为并未脱离正常组织细胞的基本模式,但与正常组织细胞通过调动迁移行为参与组织重建相反, 肿瘤细胞非时、非地及失控的迁移运动将对组织结构稳定性维持产生负面影响。

细胞迁移过程中, 诸如迁移速率、迁移效率以及细胞取向和定位等运动特性均与细胞的结构功能状态密切相关, 肿瘤细胞因其骨架活动和信号转导异常, 虽然迁移速率明显高于正常细胞, 但因迁移的方向频繁发生改变呈原位“翻滚”, 其迁移路程较长而实际位移很短, 故迁移效率远低于正常细胞。同时, 胞外基质的物理特性对细胞迁移行为也有显著影响, 正常细胞能够感应胞外的物理信号, 并相应调整其迁移行为, 如在不同硬度和微观结构的基底上, 正常细胞的迁移速率和迁移方向会随之变化, 细胞始终如一地向硬度增加的方向迁移。而肿瘤细胞则显得比较“迟钝”, 胞外基质的物理特性改变似乎对它们没有影响或影响很小。正是由于肿瘤细胞丧失位置信息的识别能力, 相对正常细胞高效及定位和取向明确等迁移运动特征, 肿瘤细胞迁移轨迹离散、相邻细胞运动协同性差, 最终导致群体细胞呈无序堆积。

研究肿瘤细胞迁移常用的是transwell迁移实验。transwell小室其外形为一个科放置在孔板里的小杯子，底层有一张通透性的膜，这层膜有微孔，孔径大小有0.1到12μm，根据不同的需求有不同的材料，常用的是聚碳酸酯膜。在肿瘤细胞迁移实验中常用8μm或12μm的膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或其他特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室迁移，计数进入下室的细胞可以反映肿瘤细胞的迁移能力。

Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择 25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在 Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在Transwell腔中培养 72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。

肿瘤细胞侵袭实验（Tumour InvasionAssay）可以：（1）研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；（2）一些抑制血管生成的新药研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。