上海细胞TUNEL检测实验

一、定义与原理

TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）检测是一种用于检测细胞凋亡（程序性细胞死亡）的分子生物学技术。其核心原理基于凋亡过程中DNA断裂形成的3'-羟基（3'-OH）末端。通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的催化作用，荧光素或酶标记的dUTP被连接到DNA断裂处，从而实现凋亡细胞的标记。

关键点：

• 特异性标记：正常细胞或增殖细胞的DNA断裂极少，因此TUNEL可特异性地标记凋亡细胞。
• 检测方式：标记后的细胞可通过荧光显微镜（如FITC标记）、流式细胞仪（定量分析）或酶标仪（如HRP显色）进行检测。

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二、实验步骤（以贴壁细胞和组织切片为例）

贴壁细胞检测流程：

1. 固定：使用4%duo聚甲醛固定细胞30-60分钟，避免过度固定导致抗原遮蔽。
2. 通透：0.1% Triton X-100处理2分钟，增加细胞膜通透性。
3. 标记：加入TUNEL反应混合液（含TdT酶和标记dUTP），37℃避光孵育60分钟。
4. 清洗与核染色：PBS清洗后，使用DAPI复染细胞核，封片后荧光显微镜观察。

组织切片检测流程：

1. 脱蜡与水化：石蜡切片需经二甲苯脱蜡及梯度乙醇水化，冰冻切片直接固定。
2. 蛋白酶处理：20 μg/mL蛋白酶K孵育15-30分钟，暴露DNA断裂位点。
3. 标记与显色：TUNEL反应后，DAB显色（酶标记法）或荧光检测，结合苏木素复染观察。

注意事项：

• 对照设置：阳性对照（如DNase I处理诱导DNA断裂）、阴性对照（不加TdT酶）是验证实验可靠性的关键。
• 避光操作：荧光标记步骤需严格避光，防止淬灭。

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三、应用场景

1. 基础研究：
   • 发育生物学：胚胎发育中的程序性细胞死亡定位。
   • 神经科学：神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）中神经元凋亡评估。
2. 疾病机制与治疗：
   • 肿瘤学：评估化疗药物诱导的癌细胞凋亡效率。
   • 心血管疾病：心肌缺血再灌注损伤中的细胞死亡分析。
3. 药物筛选：高通量检测候选药物的促凋亡或抗凋亡效应。

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四、优缺点分析

优势：

• 高灵敏度：可检测单个凋亡细胞，适用于低凋亡率样本。
• 多平台兼容：兼容荧光显微镜、流式细胞仪等多种检测设备。
• 原位检测：保留组织或细胞形态，便于观察凋亡空间分布。

局限性：

• 假阳性风险：坏死细胞或机械损伤导致的DNA断裂可能被误判为凋亡。
• 无法区分凋亡阶段：主要标记晚期凋亡（DNA断裂阶段），早期凋亡（如膜磷脂外翻）需结合Annexin V检测。
• 操作复杂性：组织切片需严格脱蜡和蛋白酶处理，否则影响标记效率。