TUNEL检测实验

一、技术定义与核心原理

TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling） 是一种通过标记DNA断裂末端检测细胞凋亡的原位技术。其核心机制基于凋亡过程中核酸内切酶激活导致的DNA特征性断裂：

1. 分子基础：
   • 凋亡细胞中，Caspase激活的核酸内切酶切割核小体间DNA，产生大量3'-羟基（3'-OH）末端。
   • 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT） 催化荧光素或生物素标记的dUTP（如FITC-dUTP、TMR Red-dUTP）共价连接至3'-OH末端。
2. 信号识别：
   • 标记物通过荧光显微镜（如FITC-绿光/TMR Red-红光）或显色底物（DAB-棕色）可视化。
   • 特异性标记：正常细胞DNA无暴露3'-OH，极少被标记；坏死细胞DNA随机断裂，标记模式呈弥散状。

关键突破：

• 高灵敏度：可检测单个凋亡细胞（灵敏度达早期凋亡阶段）。
• 多模态检测：兼容荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪及普通光学显微镜（显色法）。

二、标准化实验流程

1. 样本制备与预处理

2. TUNEL反应体系构建

1. 反应液配制：
   • TdT酶 + 标记dUTP（如FITC-12-dUTP或EdUTP）按比例混合。
   • 创新标记物：

• BeyoClick™ EdUTP-488：通过点击化学反应连接AF488，灵敏度提升2倍。
• TMR Red-dUTP：红光标记（激发550nm/发射570nm），降低自发荧光干扰。

1. 孵育条件：
   • 37℃避光反应60min（组织切片延长至90min）。
   • 阴性对照：不加TdT酶的反应液。
   • 阳性对照：DNase I处理样本（诱导DNA断裂）。

3. 信号检测与封片

• 荧光法：抗淬灭封片剂（含DAPI）封片，荧光显微镜观察。
• 显色法：Streptavidin-HRP结合生物素标记dUTP → DAB显色 → 苏木素复染。
• 定量分析：
  • 凋亡率 = TUNEL⁺细胞数 / DAPI⁺细胞总数 × 100%。
  • 流式细胞术：定量分析凋亡细胞比例。