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- 2026年01月17日
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上海达为科生物科技有限公司
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TUNEL检测实验
一、技术定义与核心原理
TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling） 是一种通过标记DNA断裂末端检测细胞凋亡的原位技术。其核心机制基于凋亡过程中核酸内切酶激活导致的DNA特征性断裂：
- 分子基础：
- 凋亡细胞中，Caspase激活的核酸内切酶切割核小体间DNA，产生大量3'-羟基（3'-OH）末端。
- 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT） 催化荧光素或生物素标记的dUTP（如FITC-dUTP、TMR Red-dUTP）共价连接至3'-OH末端。
- 信号识别：
- 标记物通过荧光显微镜（如FITC-绿光/TMR Red-红光）或显色底物（DAB-棕色）可视化。
- 特异性标记：正常细胞DNA无暴露3'-OH，极少被标记；坏死细胞DNA随机断裂，标记模式呈弥散状。
关键突破：
- 高灵敏度：可检测单个凋亡细胞（灵敏度达早期凋亡阶段）。
- 多模态检测：兼容荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪及普通光学显微镜（显色法）。
二、标准化实验流程
1. 样本制备与预处理
| 样本类型 | 固定方法 | 通透处理 | 关键参数 |
|---|---|---|---|
| 细胞爬片 | 4%多ju甲醛（室温15-30min） | 0.1% Triton X-100（10min） | 密度≤70%，避免干燥 |
| 石蜡切片 | 4%多ju甲醛固定后包埋 | 蛋白酶K消化（20μg/ml） | 脱蜡至水，抗原修复 |
| 冰冻切片 | bing酮（-20℃, 10min） | 0.1% Tween-20 | 避免反复冻融 |
2. TUNEL反应体系构建
- 反应液配制：
- TdT酶 + 标记dUTP（如FITC-12-dUTP或EdUTP）按比例混合。
- 创新标记物：
- BeyoClick™ EdUTP-488：通过点击化学反应连接AF488，灵敏度提升2倍。
- TMR Red-dUTP：红光标记（激发550nm/发射570nm），降低自发荧光干扰。
- 孵育条件：
- 37℃避光反应60min（组织切片延长至90min）。
- 阴性对照：不加TdT酶的反应液。
- 阳性对照：DNase I处理样本（诱导DNA断裂）。
3. 信号检测与封片
- 荧光法：抗淬灭封片剂（含DAPI）封片，荧光显微镜观察。
- 显色法：Streptavidin-HRP结合生物素标记dUTP → DAB显色 → 苏木素复染。
- 定量分析：
- 凋亡率 = TUNEL⁺细胞数 / DAPI⁺细胞总数 × 100%。
- 流式细胞术：定量分析凋亡细胞比例。
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文献和实验一、TUNEL法的实验原理 细胞发生凋亡时, 染色体DNA双链或单链断裂产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖
roy2929 小弟新手 实验等等都不怎么懂，希望高手们帮忙。 做TUNEL检测凋亡，除了本身没有发生凋亡和实验操作原因，还有什么可能会没有信号？比如通过其他不能用TUNEL检测到的方式发生了凋亡？ 不胜感激 qwer_214 TUNEL是一种很特异的检测凋亡的方式，它主要检测DNA特异性的断裂，恕我资历比较浅，我到目前还没有发现其他用TUNEL检测到的方式发生了凋亡。 roy2929
用了许多方法检测小鼠的肝脏、脑部、睾丸等组织的细胞凋亡，其中 TUNEL 法做的最多，我购买的试剂盒主要是 roche、 promega 公司，结果大多数成功，偶尔也有失败，下面我把实验中的关键问题与大家共享一下，同时也希望能对初学者有所帮忙。 TUNEL 法的实验原理 基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让 rTDT 和生物标记的 dTUTP 进入细胞内，在 rTDT 的辅助下 dTUTP 与核断裂的 DNA 3』-OH 结合，再用 HRP 标记的链霉
