pET-N-His-TEV-QUEEN2m (细菌ATP荧光

ET-N-His-TEV-QUEEN2m (细菌ATP荧光探针)是研发的一种用于在细菌中表达N端含有His标签(His tag)的QUEEN2m融合蛋白以作为ATP荧光探针的原核工具质粒，可以用于活体实时检测单个细菌内ATP水平或QUEEN2m的原核表达纯化。

QUEEN (Quantitative Evaluator of Cellular Energy)是一个单一的环状排列的荧光蛋白(circularly-permuted fluorescent protein)和细菌ATP结合蛋白融合表达而成。QUEEN对细菌生长速率的改变不敏感(insensitive to bacteria growth changes)。许多细菌细胞内根据QUEEN的荧光所计算的胞内ATP浓度与根据萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)方法检测所计算得出的胞内ATP浓度几乎完全一致，因此QUEEN适合用于定量检测细菌内的绝对ATP浓度。从很多单个细菌收集的QUEEN荧光信号进行分析时发现，即使是遗传背景相同的大肠杆菌细胞，在相同培养条件下，细胞内的绝对ATP浓度也是不同的。

基因编码的ATP荧光探针QUEEN7µ荧光蛋白，由环型排列的增强型绿色荧光蛋白cpEGFP (circularly-permuted enhanced green fluorescent protein)插入到嗜热芽孢杆菌(thermophilic Bacillus) PS3的FoF₁-ATP合成酶的ε亚基的两个α螺旋之间组成，在接头处分别由两个氨基酸的接头(TR和LG)进行连接。当ATP结合于FoF₁-ATP合成酶的ε亚基的时候，会引起整个蛋白发生构象变化。激发波长400nm/发射波长513nm的荧光强度与激发波长494nm/发射波长513nm的荧光强度的比值对ATP的浓度变化做出响应。QUEEN7µ是一个高亲和力的ATP荧光探针(Kd~7µM at 25℃)，但对ADP没有亲和力。对于正常的活细菌而言，QUEEN7µ对ATP的亲和力可能过高，而较难检测出较高浓度ATP水平的变化。但对于特定条件导致的细菌内低ATP水平时，比较适合使用QUEEN7µ进行ATP的荧光检测。也可以使用表达纯化的QUEEN7µ进行体外体系的ATP实时浓度检测。

基因编码的ATP荧光探针QUEEN2m荧光蛋白，是QUEEN7µ的突变体，通过用源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的FoF₁-ATP合成酶的ε亚基的1-107aa取代QUEEN7µ中的源自嗜热芽孢杆菌(thermophilic Bacillus) PS3的FoF₁-ATP合成酶ε亚基的1-107aa。仍然以激发波长400nm/发射波长513nm的荧光强度与激发波长494nm/发射波长513nm的荧光强度的比值对ATP的浓度变化做出响应。但QUEEN2m是一个低亲和力的ATP荧光探针，更适合检测ATP的生理浓度(Kd~4.5mM at 25℃)。高浓度的ADP会对QUEEN2m信号产生负面影响，但效果相对较小(在生理ADP浓度下约为10%或更少)。此外QUEEN2m信号在pH7.3-8.8和生理Mg²⁺浓度(1-2mM)范围内几乎不受影响。

图1.QUEEN7µ、QUEEN2m和QUEEN NA的蛋白结构图。

本质粒含有T7启动子/lac操纵子，可以在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下高效启动目的蛋白表达。在多克隆位点的前面，带有一个His标签的编码序列，含有6个组氨酸(6X His)。

本载体在N端His标签与多克隆位点之间含有TEV蛋白酶(TEV Protease)识别的七肽序列ENLYFQG，对应的核酸序列为GAGAACCTGTACTTCCAAGGG，因此可在QUEEN2m蛋白纯化后用TEV蛋白酶切除N端His标签。TEV蛋白酶酶切发生在七肽序列的Q和G之间，因此在酶切去除His标签的时候目的蛋白的N端会留下一个额外的氨基酸残基G。

本质粒为卡那霉素抗性。

pET-N-His-TEV-QUEEN2m质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
f1 origin	12-467
Kanamycin resistance ORF	563-1645
PBR 322 origin	2084
LacI coding sequence	3518-4597
T7 promoter	4988-5004
His tag coding sequence	5079-5096
TEV Protease recognition site sequence	5097-5117
QUEEN2m	5124-6266
T7 Terminator	6364-6410

pET-N-His-TEV-QUEEN2m质粒(6417bp)的图谱如下：

pET-N-His-TEV-QUEEN2m中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pET-N-His-TEV-QUEEN2m)包括：

AatII	Acc65I	AflII	AgeI	AhdI	AscI	AvrII
BaeI	BbvCI	BfuAI	BmgBI	BmtI	BsaI	BsiWI
BspMI	BstBI	Bsu36I	CspCI	DraI	EagI	Eco53kI
EcoRI	FseI	HindIII	KpnI	MfeI	MscI	NcoI
NheI	NotI	PacI	PmeI	PmlI	PspXI	PstI
RsrII	SacI	SacII	SalI	SbfI	ScaI	SexAI
SfiI	SnaBI	SpeI	SrfI	StuI	SwaI	ZraI

pET-N-His-TEV-QUEEN2m中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pET-N-His-TEV-QUEEN2m)包括：

AlwNI	CAG,NNN`CTG	1729	NdeI	CA`TA,TG	5074
AsiSI	GCG,AT`CGC	943	NruI	TCG|CGA	1286
BamHI	G`GATC,C	5118	PaeR7I	C`TCGA,G	6273
BclI	T`GATC,A	4228	PciI	A`CATG,T	2141
BglII	A`GATC,T	6267	PflFI	GACN`N,NGTC	2399
BseRI	GAGGAG(N)8,NN`	5779	PpuMI	RG`GWC,CY	3136
BspQI	GCTCTTCN`NNN,	2258	PshAI	GACNN|NNGTC	3401
BsrGI	T`GTAC,A	5725	PsiI	TTA|TAA	370
BssHII	G`CGCG,C	3831	PvuI	CG,AT`CG	943
BstAPI	GCAN,NNN`NTGC	4563	SapI	GCTCTTCN`NNN,	2258
BstEII	G`GTNAC,C	4060	SgrAI	CR`CCGG,YG	4923
BstZ17I	GTA|TAC	2374	SmaI	CCC|GGG	1069
DraIII	CAC,NNN`GTG	242	SphI	G,CATG`C	4771
EcoRV	GAT|ATC	5180	TspMI	C`CCGG,G	1067
FspI	TGC|GCA	3164	Tth111I	GACN`N,NGTC	2399
HincII	GTY|RAC	3740	XbaI	T`CTAG,A	5034
HpaI	GTT|AAC	3740	XhoI	C`TCGA,G	6273
MluI	A`CGCG,T	4242	XmaI	C`CCGG,G	1067

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D2906-1μg	pET-N-His-TEV-QUEEN2m	1μg
D2906-100μg	pET-N-His-TEV-QUEEN2m	100μg
－	说明书	1份

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

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