肿瘤细胞侵袭实验

一、实验原理与生物学意义

1. 核心机制

肿瘤细胞侵袭是转移的关键步骤，涉及以下过程：

• 基质降解：细胞分泌基质金属蛋白酶（MMPs）降解基底膜和细胞外基质（ECM）。
• 细胞迁移：通过趋化因子（如EGF、VEGF）介导的伪足形成和肌动蛋白重组，实现定向移动。
• 微环境重塑：整合素介导的细胞-基质黏附，调控肿瘤细胞与ECM的力学相互作用。

2. 实验设计目标

• 模拟体内侵袭：通过人工基质（如Matrigel）重建基底膜屏障。
• 定量分析能力：通过细胞计数、荧光标记或AI图像分析量化侵袭潜能。
• 多维度评估：结合分子机制（如TLR7信号通路）与形态学变化（如伪足形成）。
  
   

---

二、主流实验方法及技术对比

1. Transwell侵袭实验（最广泛应用）

• 原理：利用聚碳酸酯膜（孔径8 μm）分隔上下室，上室铺Matrigel模拟基底膜，下室添加趋化因子（如10% FBS），通过细胞穿膜数量评估侵袭能力。
• 关键参数：
  • Matrigel浓度：1-2 mg/mL可平衡屏障强度与细胞穿透性。
  • 趋化梯度：含10% FBS的培养基可诱导强趋化效应。
  • 培养时间：48小时为常见周期（HCT116结肠癌细胞穿膜率约30%）。

2. 肿瘤球体侵袭实验（3D模型）

• 构建方法：
  • U87-MG胶质瘤细胞在低黏附板中形成球体后，嵌入Matrigel观察细胞向外迁移。
  • 实时成像追踪单细胞迁移轨迹，计算平均平方位移（MSD）量化运动特征。
• 优势：更接近体内三维微环境，可研究细胞间相互作用。

3. Boyden小室改良法

• 改进点：用Ⅰ型胶原（2 mg/mL）替代Matrigel，模拟特定ECM成分。
• 应用案例：酸性微环境（pH 6.5）可使MDA-MB-231乳腺癌细胞侵袭率提升2倍。

4. 体内侵袭模型

• 尾静脉注射：4T1乳腺癌细胞经尾静脉注入小鼠，72小时后肺转移灶计数评估侵袭能力。
• 原位移植：将患者来源肿瘤组织植入免疫缺陷小鼠乳腺脂肪垫，监测局部侵袭深度。

三、标准化操作流程（以Transwell为例）

1. 实验准备

• 材料：
  • Transwell小室（Corning, 8 μm孔径）。
  • Matrigel基质胶（BD Biosciences，4℃解冻）。
  • 结晶紫染色液（0.5% w/v，含2%乙醇）。

2. 操作步骤

1. 铺胶：将50 μL Matrigel（稀释至1 mg/mL）均匀涂布于上室膜表面，37℃固化1小时。
2. 细胞处理：
   • 细胞饥饿处理：用无血清培养基培养12小时，同步化细胞周期。
   • 制备悬液：调整密度至5×10⁵ cells/mL（MCF-7乳腺癌细胞）。
3. 加样：上室加入200 μL细胞悬液，下室加入600 μL含10% FBS的培养基。
4. 培养：37℃、5% CO₂培养48小时，避免震动干扰细胞贴附。
5. 固定染色：
   • 4%多ju甲醛固定30分钟，PBS冲洗。
   • 0.5%结晶紫染色20分钟，棉签擦除未穿透细胞。
6. 成像分析：
   • 随机选取5个视野（×200），计数膜下表面细胞。
   • 或使用33%醋酸洗脱结晶紫，570 nm测OD值量化。