NADH-辅酶Q还原酶酶活测定试剂盒

QYS-23012	NADH-辅酶Q还原酶酶活测定试剂盒	微量法 100管/96样
QYS-23013	NADH-辅酶Q还原酶酶活测定试剂盒	紫外分光光度法 25管/24样

测定意义 复合体Ⅰ（EC1.6.5. 3）又称 NADH-CoQ 还原酶或 NADH 脱氢酶，广泛存在于动物、植物、 微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从 NADH 传递给 CoQ，同时可使O2 还原生成 O2.-，是呼吸电子传递链上产生O2.-的主要部位。 测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS） 生成状态。 测定原理 复合体Ⅰ能够催化NADH 脱氢生成 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 的氧化速率计算出该酶 活性的大小。 需自备的仪器和用品 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。 
试剂的组成和配制 
试剂一：25mL×1 瓶，-20℃保存； 
试剂二：5mL×1 瓶，-20℃保存； 
试剂三：0.5 mL×1 瓶，-20℃保存； 
试剂四：25mL×1 瓶，-20℃保存； 
试剂五：1 mL×1 支，-20℃保存； 
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 2mL 蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存， 禁止反复冻融。 
工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存， 禁止反复冻融。 
样本的前处理： 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 
① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰 浴匀浆器或研钵匀浆。 
② 将匀浆 600g，4℃离心 5min。 
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。 
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选 做）。 
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴， 功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于复合体Ⅰ酶活性测定。 
测定步骤： 
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 
2、 样本测定
（1） 工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。 
（2） 在 1mL 石英比色皿中加入 40μL 样本、800μL 工作液和 60μL 试剂六，立即混匀， 记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
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