醛糖还原酶测定

问：有关测定醛糖还原酶活性时的反应体系有以下几个疑问：

1、67mmol/l钠钾磷酸盐缓冲液如何配置？也有人 用50mmol/l的磷酸钾缓冲液二者哪一种更好。

2、整个反映体系配置须注意哪些问题？最后加DL-甘油醛还是NADPH。

3、NADPH标准曲线绘制分别用多大浓度？请各位指教，谢谢。

答：在测定酶的活性时，有时由于酶的纯化不足，导致影响结果，在检测醛糖还原酶活性时要注意以下几点：

（一）其它酶和物质的干扰

如组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将干扰各种还原酶的测定。临床酶测定中最典型的例子是血液中丙酮酸对丙氨酸氨基转移酶测定的干扰，由于反应体系中含有大量乳酸脱氢酶和NADH，可与丙酮酸反应消耗NADH，引起340nm处吸光度下降，假如将此NADH下降也算为ALT活性将引起误差。

其它如红细胞中腺苷酸激酶（AK）对CK测定的干扰，在CK的酶偶联体系中ADP是CK底物，但它又同时是AK的底物，二个酶反应都产生ATP，在工具酶（已糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶）作用下都产生NADH引起340nm处吸光度上升，其结果是CK测定结果偏高，为避免此种干扰，所以在反应体系中加入AK的抑制剂AMP和二腺苷酸5′磷酸。

（二）工具酶的污染

目前试剂中所用的试剂酶多从动物组织或细菌中提取，不可避免地会污染有其它酶，如不注意此问题，会引起不正确结果。更有甚者，有些工具酶中就混有测定酶，这种情况下，将产生很高的本底。所以所用的工具酶必须很纯，并检查污染酶的含量，例如测定天冬氨酸氨基转移酶所用的苹果酸脱氢酶中所含杂的AST时，按IFCC规定不应超过0.005％。

（三）非酶反应

有些底物不稳定，没有酶的作用就能自行反应，例如ALP的底物磷酸对硝基酚配成的底物溶液，室温放置过夜，即自行水解释放出对硝基成黄色。又如测醛缩酶时，其底物醛类化合物可以和NAD+起非酶反应产生一种具有类似NADH吸收光谱的化合物，给测定带来困难。

（四）分析容器的污染

如冲洗不当，分析容器和管道中混杂有各种物质，可能影响酶活性，如微量重金属可使酶失活，残留的表面活性剂可能抑制酶活性。

（五）沉淀形成

使用光学法监测酶反应时，如有沉淀形成或组织匀浆中颗粒的下沉都会引起吸光度变化，引起测定结果误差，此情况常见于底物溶解度低而反应体系中底物浓度偏高。可见于用γ-谷氨酰对硝基苯胺为底物测GGT时。