乳酸脱氢酶活力测定

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目的要求

(1) 了解乳酸脱氢酶活性测定原理。

(2) 学习用比色法测定酶活性的方法。

实验原理

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：

NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。

LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等。

本实验测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向含丙酮酸及NADH的溶液中，加入一定量乳酸脱氢酶提取液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下每分钟A340下降值为1.0的酶量为1个单位。

试剂和器材

一.试剂

50mmol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液母液：

A: 50 mmol/L K2HPO4: 称K2HPO41.74g加蒸馏水溶解后定容至200mL。

B: 50 mmol/LK2HPO4: 称KH2PO43.40g加蒸馏水溶解后定容至500mL。

取溶液A 31.5mL ＋溶液B 68.5mL, 调节pH至6.5。置4℃冰箱备用。

10mmol/L pH 6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液用上述母液稀释得到。现用现配。

0.2 mol/L pH7.5磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液母液：

A: 0.2 mol/L Na2HPO4: 称Na 2HPO4·12H2O 71.64g加蒸馏水溶解后定容至1000mL。

B: 0.2 mol/L NaH2PO 4: 称NaH2PO4·2H2O 31.21g加蒸馏水溶解后定容至1000mL。

取溶液A 84 mL ＋溶液B 16 mL, 调节pH至7.5。置4℃冰箱备用。

0.1mol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液, 用上述母液稀释得到。现用现配。

NADH溶液：称3.5mg纯NADH置试管中，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液 1mL摇匀。现用现配。

丙酮酸溶液：称2.5mg丙酮酸钠，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液29mL, 使其完全溶解。现用现配。

二.材料

兔肉。