YJ105 GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶

GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶
Glutathione Agarose Resin
本产品 4℃运输；保存于 4℃，禁止产品冻结，长期存放请保证试剂管竖立向上，凝胶浸没于保护液中，保质期24 个月。

货号规格
goodYJ105     1 mL×10

产品简介
good本产品可用于纯化各种表达系统融合表达的 GST 重组蛋白，其是以由高度交联的 4% 琼脂糖凝胶为基质，通过 12 个原子的间隔臂，用化学方法共价结合还原型谷胱甘肽制作而成。

产品参数

自备试剂

操作步骤
good◆ 样本处理(以大肠杆菌表达系统为例)
good◆gg1. 离心收集大肠杆菌(4℃，4,000×g，30 min)，弃上清；
good◆gg2. 用冷1×PBS(货号：PS110)重悬细胞, 如果需要，可加入适量的添加剂，如非离子去污剂(NP-40)或蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)；
good◆gg3. 用超声波破碎法在冰上破碎菌体，直到样品破碎完全；
good◆gg4. (可选)如果裂解物太过粘稠，可以加入RNase A(终浓度10 μg/mL)和DNase I(终浓度5 μg/mL)并在冰上孵育10~15 min；
good◆gg5. 离心收集上清(4℃，12,000×g，20 min)；
good◆gg6. SDS-PAGE分析GST融合蛋白的含量及可溶性；

good◆ 纯化重组GST融合蛋白
good◆gg7. 轻轻重悬GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶 ，吸取适量加入重力柱中，用10倍柱体积的冷1×PBS(货号：PS110)平衡GST琼脂糖凝胶；
good◆gg8. 将步骤5制备好的含有GST融合蛋白的上清液加入到纯化柱中，流速控制为0.5~1 mL/min；
good◆gg9. 蛋白上清液全部流出纯化柱后，立刻加入1×PBS清洗纯化柱，所需量大约为柱体积的 20倍或者直到流出液的A280值达到最低且稳定；
good◆g10. 用10~15倍柱体积的现配 洗脱缓冲液 以0.5~1 mL/min的流速洗脱，收集洗脱液。或者根据流出液A280值判断，当数值陡然上升时开始接收洗脱液，直到A280数值降至最低且稳定时，停止收集。后续可根据目的蛋白的性质和用途，4℃透析到20 mM Tris-HCl，pH 8.0或者1×PBS，pH 7.4中，以去除游离的谷胱甘肽。

good◆ 凝胶再生及储存
good◆ GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶 可以重复使用，但随着使用次数增多，非特异性结合的蛋白聚集往往会造成流速和蛋白结合载量的下降，这时便需要对琼脂糖凝胶填料进行清洗。
good◆g11. 使用5倍纯化柱体积去离子水清洗琼脂糖凝胶填料；
good◆g12. 使用2倍柱体积的6 M盐酸胍溶液进行清洗；
good◆g13. 使用5倍柱体积去离子水清洗填料；
good◆g14. 使用3~4倍柱体积70%乙醇或2倍柱体积的1%Triton X-100清洗填料；
good◆g15. 使用5倍柱体积去离子水清洗填料，即完成琼脂糖凝胶填料再生。
good◆g15. 注：填料再生后，可以立即使用，如不立即使用，需要将填料悬浮于等体积的20%乙醇中，置于 4℃保存。

注意事项
good1. 琼脂糖凝胶应保存在储存溶液中，防止干燥；
good2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
good3. 本产品仅限科研使用。

常见问题解析
 

问题	原因	解决方案
GST融合蛋白的产量低或无法检测到	融合蛋白形成包涵体	采用低温(16~25℃)培养细胞，或者诱导过程中降低诱 导剂的终浓度至1 mM，或者缩短诱导时间
		纯化前需要完全融解和复性。将裂解液与GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶在摇床上轻摇2个小时或者更长时间(过夜)，充分结合
	融合蛋白可能失活	采用温和的超声破碎条件或者其它的裂解条件，比如采用溶菌酶
	融合蛋白被蛋白酶降解	在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑制剂
	融合蛋白不能有效地从树脂上洗脱下来	延长洗脱时间，或者增加洗脱缓冲液中还原性谷胱甘肽的浓度至15 mM或者更高
		调节洗脱缓冲液的pH值至8.0~9.0
		在洗脱缓冲液中加入Triton X-100(终浓度0.1%)、辛基-葡萄糖苷(终浓度2%)或者NaCl(终浓度0.1~0.2 M)
洗脱缓冲液中有较多杂带	融合蛋白被蛋白酶降解	在裂解步骤或漂洗步骤加入适量的蛋白酶抑制剂
	一些宿主蛋白，比如伴侣蛋白，可能会和融合蛋白互相作用	在漂洗缓冲液中加入DTT(终浓度5 mM)。在纯化前将重组蛋白溶液和伴侣蛋白溶液(2 mM ATP, 10 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl)37℃振荡10 min
	过度的超声处理会导致一些蛋白与融合蛋白相结合	采用温和的超声破碎条件或者其它的裂解条件
	有些蛋白会与融合蛋白或树脂发生非特异性结合	优化漂洗条件：加入一些洗涤剂如1% Triton X-100、 1% Tween-20、0.03% SDS或者0.1% NP-40可以降低非特异性吸附；优化漂洗缓冲液中的盐浓度也可以降低非特异性吸附