人间充质干细胞无血清培养基

• 人间充质干细胞完全培养基配制：

1. 添加剂处理：37℃快速解冻人间充质干细胞培养基添加剂（RC200101-B），快速溶解有利于保护添加剂中营养物质不被破坏，时间约为10分钟。添加剂融化后轻轻充分摇匀，分装或直接按比例添加到基础培养基中，分装后添加剂立即存储于-20℃至-80℃，避免反复冻融。
   注意：刚融化的培养基添加剂可能会有溶解不充分，出现类似沉淀物，请务必充分混匀，以保证添加的均匀度。
2. 完全培养基配制：将添加剂以10%比例加入到人间充质干细胞基础培养基（RC200101-A）中，充分混匀，即配制成人间充质干细胞完全培养基（RC200101）。完全培养基在2-8℃可稳定储存2-3周，超过3周的完全培养基请谨慎使用。
   注意：混合成人间充质干细胞培养基后必须充分混匀，2-8 ℃保存。整个过程确保无菌操作，各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。完全培养基使用前务必室温复温30分钟。

• 自备试剂：

• 消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他）
• 磷酸盐缓冲液（DPBS）
• 细胞冻存液

• 原代细胞培养（羊水、全血、全骨髓培养发法、酶消化法）：

1. 该部分以单细胞悬液为操作起始。单细胞获取方式包括但不限于使用胰酶、胶原酶、分散酶等酶消化法从脂肪、脐带、羊膜、皮肤等组织获得；使用离心法直接从羊水、全血、全骨髓获得。
2. 原代接种：以上方法获得的细胞沉淀，漩涡震荡使其分散为单个细胞，加入适量的完全培养基，充分混匀。200 g离心5-10分钟。弃去上清，漩涡震荡使沉淀分散为单个细胞，加入适量的完全培养基，充分混匀。按照一定的细胞密度接种与培养器皿中。37℃、5%CO₂、饱和湿度静置培养48小时。该时间段内请勿移动培养器皿，也无需观察。48小时后观察细胞，根据情况选择半量或全量更换新鲜完全培养基。
3. 换液培养：后每48小时更换新鲜培养基。观察细胞，弃去原培养上清。若悬浮细胞较多，则可用DPBS轻轻洗涤细胞1-2次。添加新鲜完全培养基继续培养。
4. 传代：原代细胞传代以克隆大小和克隆中心细胞密度为标准。若克隆中心细胞密度较大，则不论整个培养器皿是否长满均应进行传代操作。弃去培养上清，加入适量的DPBS，轻轻晃动后弃去DPBS，重复洗涤2-3次。加入适量的0.25%胰蛋白酶消化液室温消化2分钟，加入2倍体积的完全培养基终止消化。用移液管、吸管、移液枪头等轻轻吹打细胞，使其从培养皿表面脱落。
5. 冻存：参照下述“hMSC细胞冻存”。

• 原代细胞培养（组织块法）：

1. 该部分以组织块作为起始。组织块包括但不限于脐带、羊膜、皮肤等来源的切成1-3 mm³大小的组织块。
2. 原代接种：用缓冲液清洗过的组织块，用适量的完全培养基悬浮，300目无菌滤网过滤或200 g离心5-10分钟，收集组织块。用适量的完全培养基重新悬浮组织块，均匀接种于培养皿中，37 ℃、饱和湿度、5%CO₂静置培养。48小时内最好不要对培养器皿进行任何移动。
3. 换液：48小时后进行半量换液或全量换液，具体视情况而定。每2天更换新鲜培养液。组织块周围有密度较高的细胞时，可以选择去除组织块。
4. 传代：参照上述“传代”方法。
5. 冻存：参照下述“hMSC细胞冻存”。

• hMSC细胞传代培养（非原代）：

1. 在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到90%，即可传代。
2. 弃掉培养上清，加入DPBS溶液清洗1次，加入细胞消化液使之完全覆盖培养器皿底部。
3. 室温孵育1分钟，轻轻拍动培养器皿，显微镜下观察大部分细胞从培养器皿底部脱落后立即停止消化。
4. 加入消化液2倍体积的人间充质干细胞完全培养基，用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，使细胞完全脱落并均匀分散。
5. 将细胞悬液转移到离心管中，200 g离心5分钟。
6. 弃上清，加入人间充质干细胞完全培养基，重悬细胞，计数。1：3-1：6比例传代，均匀铺在培养皿/瓶中，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养。

• hMSC细胞复苏：

1. 从液氮中取出冻存的hMSC细胞，迅速将冻存管/冻存袋放入复苏装置或37℃水浴快速融化。
2. 将解冻后的细胞悬液缓慢加入适量已复温的人间充质干细胞完全培养基（冻存体积与培养基的体积比为1：5-1：10）。
3. 200 g离心5分钟，吸掉上清，加入适量的人间充质干细胞完全培养基重悬细胞。
4. 将细胞均匀铺到培养器皿中，摇动培养器皿使细胞均匀分布，5%CO₂的37℃培养，24小时后观察细胞状态。
5. 24小时后更换新鲜人间充质干细胞完全培养基继续培养，每2天更换培养液。
   注意：细胞传代所需的时间：2-4天。hMSC消化极易过度，建议稀释0.25%胰酶消化液一倍，且严格控制消化时间。

• hMSC细胞冻存

1. 细胞达到90%汇合度，弃掉原有培养基，DPBS清洗1次。
2. 加入细胞消化液使之完全覆盖培养器皿底部，室温孵育1分钟，轻轻拍动培养器皿，显微镜下观察大部分细胞从培养器皿底部脱落后立即停止消化。
3. 加入消化液2倍体积的人间充质干细胞完全培养基，用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，使细胞完全脱落并均匀分散。
4. 将细胞悬液转移到离心管中，200 g离心5分钟，吸掉上清。
5. 加入适量细胞冻存液，调整细胞冻存密度在1×10⁶ cells/cm₂左右，每支冻存管分装0.5-1 ml，使用冻存袋冻存请自行根据需要选择冻存方案。
6. 程序降温仪冻存，或放入冻存盒然后置于-80 ℃或直接放入-80 ℃，24小时后转入液氮中长期保存。
    
   特别提示：以上所有操作均在无菌细胞培养室进行，细胞开放操作要在生物安全柜内进行；hMSC切忌消化过度，过度的消化会导致细胞快速老化，且失去部分或全部分化能力；正常条件下hMSC可传代至15代，实验室具体可操作的传代次数请自行分析判断，并建议以分化能力进行判别；该培养基只用于hMSC细胞培养，操作规程仅作为参考。
    

Ding B, Lou W, Fan W, et al. Exosomal miR‐374c‐5p derived from mesenchymal stem cells suppresses epithelial‐mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma via the LIMK1‐Wnt/β‐catenin axis[J]. Environmental Toxicology, 2023.

赵鹏. 人VEGF基因修饰脂肪源间充质干细胞的成骨特性研究[D].南华大学,2020.

 

   

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