人间充质干细胞成脂诱导试剂盒培养基

产品特点：

小包装。采用100ml装，使用更节约、更方便；

简约装，升级产品、组成更简洁、操作更方便；

更稳定，产品系统误差更小，使用更稳定。

适用研究：

人间充质干细胞分化能力鉴定，脂肪再生医学与组织工程研究，人间充质干细胞产品质量控制，材料学研究，发育研究

适用细胞：

人骨髓、脂肪、脐带、羊膜间、牙髓、脐带血间充质干细胞，其他组织来源的人间充质干细胞。大鼠、犬、小鼠等其他物种来源的间充质干细胞。

诱导周期：1-4周

判定方法：油红O染色

产品使用效果图：

产品使用效果图：

1、成骨诱导，诱导第7天可见明显钙沉积出现、诱导10-14天基本达到足量的钙结节；
2、成脂诱导，诱导3天便可见小脂肪滴出现，诱导7-12天可完成鉴定，满足拍照需求；
3、成软骨诱导，按照说明书操作，方法简单，可进行切片染色和直接染色鉴定，建议使用切片染色。

特别提示：
该系列试剂盒适用于人间充质干细胞分化能力鉴定，提供染色试剂。若选用其他指标鉴定，如钙含量、脂肪含量、基因表达量等，则需要自备相关试剂。
该系列产品是鉴定使用，若细胞不符合要求，则形成率可能会低、甚至不会出现预期结果。

人间充质干细胞成脂诱导试剂盒
仅用于科学研究

产品信息
产品名称：人间充质干细胞成脂诱导试剂盒
货号：FY200007
批号：见包装
存储与有效期：
组分A、D、E于2-8 ℃避光保存，组分B、C于-20 ℃避光保存。所有组分均须避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的完全培养基于2-8 ℃保存，有效期1个月。
适用细胞：
人骨髓间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人羊膜间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人脐带血间充质干细胞，其他组织来源的人间充质干细胞。
产品介绍
间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。在多种组织来源和制作方法的MSC药品质量控制中，成骨、成脂、成软骨也是必检指标。
为满足科研和制药对MSC分化能力的鉴定，弗元生物结合多年MSC研究经验优化MSC诱导试剂盒，在稳定性、易用性上大幅改进，采用了独创的小包装。该试剂盒的设计用途，首先，用于鉴定人MSC是否具有成脂分化能力，满足MSC质量控制的要求。其次，诱导培养基还可用于研究诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、油脂定量检测、免疫组化检测等。再者，该产品诱导MSC分化为的脂肪细胞多为多泡脂肪细胞样，当脂肪滴融合过大时容易脱壁，难见单泡脂肪细胞样。用于脂肪研究可斟酌使用本产品。
本产品仅适用于科学研究。
操作方法
实验准备
u 试剂配制：
诱导液B：2-8℃过夜融化添加物B液，B液使用前须37℃复温30分钟，充分混匀。将基础培养基A液平均分成2份，各45 ml，加入添加物B液配制成完全诱导培养基B，充分混匀。
诱导液C：2-8℃过夜融化添加物C液，加入基础培养基A液的另一份45 ml，配制成完全诱导培养基C，充分混匀。
注意：添加物B液必须充分复温，内容物充分解冻为透明无沉淀。混合成诱导完全培养基后必须充分混匀，2-8 ℃保存。整个过程须确保无菌操作，各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。
油红O染液（工作液）：取油红O储液，与蒸馏水以3：2的比例混合均匀，中性滤纸过滤，即配制成了油红O染液（工作液）。
u 培养皿处理：
加适量包被溶液D液到培养器皿中，轻轻摇动使其覆盖整个培养器皿底面，室温静置30-60分钟。弃去溶液，室温晾干。
注意：包被液C使用前必须进行室温复温。建议使用六孔板，每孔加D液1 ml，使用其他培养器皿时需考虑实验结果的稳定性。整个过程需在超净工作台中操作，避免污染。
u 自备试剂：
l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ）
l  磷酸盐缓冲液（DPBS）
l  MSC完全培养基
l  4%中性多聚jiaquan溶液
注意：若MSC完全培养基不含血清，则需要准备胰酶抑制剂。MSC消化极易过度，建议稀释0.25%胰酶消化液一倍，且严格控制消化时间。
操作步骤
1.      准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，并用MSC完全培养基重悬。
2.      按照3×10⁴ cells/cm²的密度将细胞接种于已包被处理的六孔板中，每孔MSC完全培养基2 ml，37℃、5%CO₂培养箱中培养。
注意：细胞密度为该试剂盒的标准密度，可根据实验室情况进行调整，调整依据参照所检测MSC正常传代的密度的2倍接种，培养24小时后添加诱导培养完全培养基；或接种密度低，待细胞生长至下一步要求的密度后进行诱导。
3.      当细胞融合达90%时，弃去培养上清，每孔添加诱导液B 2 ml/孔，37℃、5%CO₂培养。
注意：成脂诱导后细胞易脱壁，换液时完全培养基必须经室温复温30分钟。添加培养基时动作要轻柔，沿培养器皿侧壁缓缓加入，避免吹起细胞。细胞起始诱导融合度对诱导效果十分关键，必须确保细胞生长至足够密时再进行诱导。
4.      诱导培养72 小时后弃去原培养上清，添加诱导液C 2 ml/孔，37℃、5%CO₂继续培养。
5.      继续诱导培养24 小时后弃去原培养基，添加诱导液B 2 ml/孔，37℃、5%CO₂继续培养。
6.      重复步骤4、5约3-5次，待细胞内出现明显脂滴时更换为诱导液C继续培养。
7.       注意：一般在培养4天左右高倍镜下能看到细胞浆内有较多数量的圆形亮泡，5-9天融合为较大的亮泡，这些结构围绕在细胞核周围，较大的与细胞核大小相当。状态较好的细胞10天内可结束培养过程，若10天后仍未见脂滴结构，请注意分析操作步骤与其他原因。
8.      每2天更换新鲜诱导液C，继续培养至脂滴足够大时培养结束。
注意：换液时诱导液必须经过复温，否则影响诱导效果和可能导致细胞脱壁。根据实验需要选择培养结束时间，若成脂面积过大或脂滴过大导致连成片则不利于结果的呈现，建议提前终止。不同实验室MSC诱导时出现脂滴的时间不尽相同，若大面积出现脂滴较早，则可提前更换为诱导液C。
9.      诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚jiaquan溶液2 ml/孔室温固定细胞20分钟。
注意：培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己的检测方法则后续方案需要自己拟定。
10.  弃去固定液，DPBS洗2次，加入油红O染液（工作液）1 ml/孔染色15分钟。
注意：该步骤适用于鉴定成脂能力，若出现脂滴（脂肪细胞）则会呈现红色着色。若需要得到美观的图片，则染色时间需自己掌握。
11.  弃去油红O染液（工作液），DPBS洗3次。
注意：染色后肉眼可见孔内明显染红。染色过程中一定要避免组织细胞被风干，风干会影响显微观察效果。
12.  显微镜下观察并拍照。
注意：拍照一般选用高倍镜，请根据需要确认选择。
13.  结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见大面积红色着色点，20倍和40倍镜下可观察到红色球形在细胞内的情况，此红色着色球为脂滴，说明实验所用的MSC具有成脂能力。否则，所使用的MSC无成脂能力。
注意：该判定标准仅进行定性分析，若需要进行定量分析，需要自行制定方案。

弗元生物推出间充质干细胞鉴定相关产品系列，为间充质干细胞研究提供优质的产品与服务。

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弗元生物，致力于打造具有国际影响力的生物医学品牌。

弗元生物立足于生物科技蓬勃发展的上海，与张江药谷、中科院、三甲医院等生物医学领域的各企事业单位协作紧密，共同为中国生物医学研究贡献力量。公司以干细胞与再生医学研究为核心，业务经营范围辐射到细胞生物学、分子生物学、免疫学等生物医学领域的多个相关学科。

至2019年初，公司有技术服务事业部、再生医学事业部和生命科学事业部三个主要发展部门。目前，在国际期刊杂志发表论文7篇，中文核心期刊发表论文1篇，申请国家发明专利4项，拥有商标9项；生命科学事业部，已经上市科研产品十余项，在研产品数十项；再生医学事业部，具有在研项目多项，包括间充质干细胞治疗缺氧性脑病、再生医学软骨、再生医学骨等，生物人工肝；技术服务事业部，服务了多家企业和科研机构，在再生医学的基础和转化研究上进一步完善了服务体系。