牛腺病毒3型 PCR 试剂盒

牛腺病毒3型PCR试剂盒

Bovine Adenovirus(BAV-3)

产品及特点

牛腺病毒 3 型（Bovine Adenovirus Type 3，BAV-3），主要引起牛的呼吸道和 肠道疾病，其主要特征为肺炎、肠炎、结膜炎和多发性关节炎，是犊牛死亡的重要原因 之一。其易感和潜伏性给畜牧业及其国际贸易带来严重的经济损失。此外牛血清的质量 控制标准中有一项重要的指标是病毒的检测，其中就有 BAV-3，因为它能给细胞培养 带来干扰。为此，本公司根据荧光定量 PCR 原理，开发了本产品。它具有下列特点：  

 

1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2. 根据牛腺病毒 3 型保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。

5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。 

牛腺病毒3型PCR试剂盒规格及成分

编号	成分	规格
试剂一	2×qPCR MagicMix	500μL（棕色管）
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	牛腺病毒 3 型 PCR 引物混合物	100 μL（白盖）
试剂四	牛腺病毒 3 型 PCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（黄盖））
试剂五	天净沙核酸释放剂（试用装）	20 次（1 mL，绿盖）
试剂六	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。 

自备试剂 DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。 
 

 

使用方法 一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万 不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 段作为阳性对 照。

2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照）， 一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的 PCR 阳性对照的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓度为 1×10E5 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求 的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品， 则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。

9. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。

三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上 步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性 分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用 第 4 号阳性对照稀释液，浓度为 10000 拷贝/μL）。下面只描述定量分析的步骤， 定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。

11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕 后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性 对照管	PCR 阳性 对照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
牛腺病毒 3 型 PCR 引物混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 待测样品 DNA 模板）	6 μL
第 7 步所得 PCR 阳性对照 稀释液（2-7 号）			各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行 优化）。 

过程	温度	时间
预变性	95℃	3 分钟
PCR反应 （40 个循环）	95℃	30 秒
	60℃	60 秒

 

 

四、数据处理

13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵 轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等 于 35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 35 则为阴性，如果小于或等于 30 则为 阳性。如果在 30-35 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 35 则 为阴性，如果小于 30，则为阳性。

本试剂盒适用于各种 RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用AMV进行反转录反应，能够获得更长的反转录产物。同时，在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。本试剂盒中配置的酶均为进口的酶。RT酶采用进口的AMV，所以cDNA更长，基因的信息保留得更完整！反转录过程中特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。本试剂盒使用方便、快捷，可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。
注意：
1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

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