Mutation 定向突变试剂盒

Catalog NO.SCMP-10
产品规格： 10次反应
试剂保存：-20℃保存，不宜反复冻融


产品简介：

本产品通过引物设计导入突变，并采用高保真的HiFi-Pfu酶，由PCR分别生成多个突变DNA片段，然后通过同源重组将这些突变DNA片段相互连接，并与载体进行融合，经转化后产生突变后的基因。



产品优势：

1.灵活性大
打破了突变只能在质粒上进行的束缚。突变所需的PCR模板不但可以来自质粒，也可来自以其他形式存在的DNA。而且不同来源的多个突变DNA片段通过同源重组可一次性组装成所需的突变基因。重组过程不需T4 多聚磷酸激酶和连接酶。
2.突变域大
可以实现几个碱基的替换、插入或缺失，还能进行几十个碱基的插入或缺失。
3.突变的真实性
由于采用高保真HiFi-Pfu聚合酶，可以得到高达95％的突变体，不会引入多余突变。而且通过优化条件将PCR循环数降至最低，PCR过程中的次生位点突变（目标突变以外的突变）的可能性极小。
4.操作简单
不需使用磷酸化引物、不需Dpn I内切酶对甲基化的质粒DNA模板降解。





操作过程：




(一）载体线性化
采用酶切或PCR扩增方法可以将载体线性化。建议利用双酶切,因为质粒的线性化不彻底将会导致大量阴性克隆的产生。如使用PCR扩增获得线性化质粒，所用的酶应选用高保真酶（如Pfu聚合酶）。

（二）引物的设计
首先，设计引物时应该在遵循常规引物设计原则的基础上，把突变设计入引物。其次，引物的纯度对突变成功率有很大影响，因此使用HPLC或PAGE纯化的引物。

1.载体两端的引物设计

引物末端应与载体末端至少具有10-15个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了10-15个与载体序列同源性的碱基。





2.突变引物的设计







3.PCR扩增

（1）使用设计好的引物分别进行多个突变DNA片断的PCR扩增：





（2）按以下2步法扩增条件进行PCR：



（3）如果按上述条件操作结果不理想，可尝试按以下3步法扩增条件进行PCR：




4.突变片断的组装

（1）将多个突变PCR片段和线性化载体以摩尔比1:1加到试管中进行组装反应，较长的PCR片段要增加其添加量，以维持其适当摩尔数目：



（2）混匀后在42℃孵育30分种，然后转移到冰上。
（3）使用5 μl反应液转化到感应态细菌中。