彩色qPCR试剂盒 A0012

一、试剂盒简介

本试剂盒采用了具有超强扩增能力和抗干扰能力的热启动DNA聚合酶，结合其高度优化的缓冲液体系和染料系统，使之具备了更强的扩增效率、抗干扰能力，更高的灵敏度和特异性。具有起峰更早，在相同情况下得到的荧光信号更强，Ct值更小，熔解曲线特异性更高等特点。
该试剂盒中EZBioscience™ 2× Color SYBR Green qPCR Master Mix预混了蓝色惰性染料，当其与预混有黄色染料的样品缓冲液混合后，混合液会变成黄色。这在移液时为实验人员提供了视觉帮助，能够极大地降低发生移液错误的风险。

二、产品组分

Components	A0012 (500Rxns)
EZBioscience™ 2× Color SYBR Green qPCR Master Mix*1	5 ml
Sample Buffer (40× )	500 µl
50× ROX Reference Dye 1*2	220 µl
50× ROX Reference Dye 2*2	220 µl

*1：包含Hot-start DNA Polymerase, dNTPs, Mg²⁺, 和blue dye。
*2：用于校正不同孔之间产生的荧光信号误差。

 

三、试剂保存条件

本试剂建议置于-20℃避光保存。

 
四、适用的仪器型号

本试剂盒适用于所有的荧光定量PCR仪：
 

使用ROX种类	qPCR仪型号
不加ROX	Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™; Cepheid SmartCycler®;  Roche LightCyclerTM 480; Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000; Thermo Scientific PikoReal Cycler.
加ROX1	ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne™, StepOne Plus™
加ROX2	ABI 7500, 7500 Fast, Quanti-Studio 3, 5, 6, 7, 12K Flex, Dx, ViiA™7; Stratagene MX4000™, MX3000P™, MX3005P™

 

五、关于qPCR反应是否良好的判断：

1、如果扩增曲线呈典型的S型曲线，背景荧光信号阶段、荧光指数扩增阶段及平台期均完整可见，熔解曲线单峰，内参Ct值在合理范围内（通常可在13 ~ 22之间，典型的内参Ct值在15 ~ 20之间），则可认为该反应正常；
2、如果同一个模板和引物的重复孔数据Ct值相差0.5以内；
同时满足以上两个条件的可以认为数据可用。
 

六、常见的注意事项、操作要点及优化方法：

1、实验开始前首先验证引物是否适用，标准与上述标准类似，主要观察扩增曲线与熔解曲线；
2、引物验证后应该分装为几份，防止污染或降解；
3、RNA的质量及cDNA的质量对qPCR的结果具有很大的影响，应尽量保证RNA不降解，通常建议RNA提取后尽快进行逆转录，避免反复冻融，或者多次逆转录。如果预计使用量较大，则可以一次多逆转几管cDNA。如果条件允许，cDNA建议优先保存在-80℃冰箱
 

七、关于qPCR引物的设计：

1、首先可以查询Google Scholar中的文献当中的引物，通常中等及以上水平期刊中的qPCR引物绝大多数可以直接使用；
2、NCBI数据库的Blast数据库中的primer blast提供了针对序列或者Gene ID的qPCR引物设计方案，可以每个基因设计2对引物，并进行合成、验证；
3、Primer Bank数据库中有部分已经验证过的引物可用，也可作为参考。