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- 2026年02月08日
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武汉康测科技有限公司
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超低起始量Nano UMI MeRIP-seq
超微量MeRIP-seq（Methylated RNA immunoprecipitation with next generation sequencing,甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序技术）是在转录组层面研究细胞内mRNA以及LncRNA的甲基化，即m6A（腺嘌呤N6位甲基化）定位的技术。
其基本原理直接针对total RNA进行m6A抗体富集，利用残留的rRNA增加建库RNA起始量，并使用UMI 超低起始量建库方式建库，之后剔除rRNA，二次扩增获得最终的文库。经过测序后，测序数据可以在整个转录组层面揭示RNA甲基化—这种转录后RNA表观修饰的定位，整体状况等信息。
二、项目流程
上图：文库构建流程
上图：实验分析流程
三、康测科技技术优势总结
1.超低建库起始量，样品准备不再难：建库起始量降低一个数量级，只需要1ug或106个细胞即可建库，样品准备更轻松；使用Novaseq测序，推荐数据量10G，完整项目周期为50个工作日。
2.数字标签还原真实，避免失真结果。
3.设置Input对照，去除背景干扰。
4.丰富项目积累，无惧困难挑战：康测科技已完成上百个IP（ChIP、RIP、CLIP、MeRIP）项目，积累了动植物、微生物近50个物种的IP经验，涉及各种类型的蛋白，如组蛋白、转录因子、解旋酶、剪接因子等，不惧复杂组织挑战。
四、部分结果展示
五、案例解读
RNA甲基化m6A修饰调控造血干/祖细胞分化
脊椎动物造血干/祖细胞（HSPC）来源于生血内皮，通过内皮-造血转换（EHT）在主动脉血管底部产生。敲除RNA甲基转移酶Mettl3造成胚胎造血功能发育受损，EHT被抑制，内皮细胞不能分化为HSPC。Mettl3敲除后，全基因组的m6A水平均下降（MeRIP-seq结果显示，m6A修饰水平下调基因多达4593个，上调仅478个，m6A修饰水平下调的基因可能为Mettl3的调控靶标，GO富集到RNA处理、胚胎发育相关term（图a-d)。
正常和敲除Mettl3的胚胎的内皮细胞进行RNA-seq，检测到Mettl3敲除胚胎中2393个基因表达上调。关联分析RNA-seq和MeRIP-seq结果，在Mettl3潜在靶标中，680个基因表达显著上调，其中Notch1a是上调最显著的基因之一，同时m6A修饰显著下调（图f)，很可能是受m6A调控的HSPC分化关键基因,m6A修饰水平下调，导致m6A介导的mRNA降解途径被抑制、Notch1a表达上调，最终造成造血发育受损。
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文献和实验流程如下： 基于 TCR/BCR 检测的 V(D)J 区域靠近 5' 端，故免疫组库测序所用磁珠标签序列由也单细胞最末端的 polydT 序列改为 TSO 序列，构成 read1+barcode+UMI+TSO 的标签组成，用于单细胞的捕获识别和后续 5' 端 RNA 的抓取捕获。 如图, 凝胶珠上的序列中，barcode 序列用于标记细胞，UMI 序列用于标记转录本，而 TSO (template switch oligo) 用于 5’ 端捕获。 当磁珠与细胞结合并在油包水环境中反转
1+barcode+UMI+TSO的标签组成，用于单细胞的捕获识别和后续5'端RNA的抓取捕获。 如图, 凝胶珠上的序列中，barcode序列用于标记细胞，UMI序列用于标记转录本，而TSO (template switch oligo)用于5’端捕获。 当磁珠与细胞结合并在油包水环境中反转成cDNA后，我们对获得的cDNA序列进行扩增，对转录组文库构建方式同单细胞测序实验，免疫组富集文库则需额外设计2次引物binding到C区，对TCR/BCR序列进行富集，后期对富集cDNA随机打断，获得不同
：Buffer、体系、孵育时间、spike-in DNA 量以及建库制备和纯化过程。 图 6：不同细胞量 mESCs 的 uliCUT&RUN 数据结果[4] 将不同细胞量 mESC 的 uliCUT&RUN 数据中的 CTCF 和 H3K4me3 测序结果与已有文献发表的 ChIP-seq 数据进行 read 密度可视化比较，发现 10 个细胞起始量的测序结果可以展现出类似 50 万细胞量的结合位点富集热图。其中 CTCF 的结合区更为狭窄集中，而 H3K4me3 则占据相对宽的区段。 ✦
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