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- 2025年11月21日
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FITC标记套装
FITC标记套装
保存条件：FITC -20度保存，其他常温保存。
产品说明：本套装是将FITC标记的常用试剂集合为一体而成。适合于蛋白等含有氨基物质的标记。特别是抗体的标记。
如果待标记物分子量太小（如小于5KD），可能并不适合用此套装（主要是后期纯化去除未标记上的FITC，可选用透析袋）。
标记原理：在高PH下FITC可蛋白等分子的氨基相连，形成共价健。
操作方法：
一，标记量的计算：FITC分子量为389.4。一般为FITC：待标记物＝10：1左右。比如抗体IgG分子量一般为150－160KD。则1mgHRP可标记抗体40mg之间。
二，计算好各步反应时间。作好开始标记的准备工作。因为标记是在PH为9.5的条件下反应，如果待标记物本身盐含量很低并且缓冲力差，如生理盐水，可等二天再准备。如果不确定，将0.2M PH9.5 CB稀释20倍，作为透析液，将待标记物装入透析袋中4℃透析过夜，透析袋适当留长约1ml体积的量以备第二天加入酶（透析袋用双蒸水清洗三次，祥细使用请见附录）。
三，如果样品缓冲能力很小（固体可用水溶解），加入1/20体积的0.2M PH9.5 CB，混匀。
四，准备层析柱（使用方法见附录）。
五，在样品准备好的情况下，称量2mg左右FITC（请不要一次称量过小，称量过小时，误差会很大），加入1ml DMSO溶解。取适量溶解好的FITC，加入准备好的样品迅速混匀。避光常温反应两小时或者4℃反应过夜。
六，加入1/20体积的1M NH4Cl，避光4℃反应两小时。
七，过柱。请保证总溶液体积不超过总体积的1/5。比较理想的是在1/10。也就是10ml凝胶，最多过柱1ml的标记液（此步也可以改为透析。一般避光透析两天左右，到没有明显黄色出来为止）。
附透析袋使用方法：
本透析袋已预处理过，用双蒸水清洗后将水用适当吸一下。就可直接使用。透析袋上下都可以用铁夹，但如果铁夹不够用，下部可用细线或者其他的透析袋夹。
将透析袋轻轻的折上两到三折。用线或者透析袋夹封住，上面支开，加入待透析物，留一定量的空气在顶上，并小心的折一折，用铁夹夹住，轻轻的挤压，如没发现有液体流出，可放入透析液中。一般透析可用纯净水瓶去顶使用。用一次性筷子或者其他合适物穿过铁夹，将透析袋吊在透析液中，补充透析液，使透析液盖过透析袋中的液面而不要淹过铁夹下面。
分子筛柱使用方法：
取空柱，加入双蒸水冲洗三次，找一合适的地方架好，下面收集废液，将Sephadex G-25取出摇匀，轻轻的沿壁倒入柱中（用去尖移液器加入也可以），等液体流出少量时，不停的补加凝胶到一合适的体积。一般加到10ml左右。在上口留出1－2ml空间。灌完胶后，用三倍体积的双蒸水冲洗（从上面加入，下面自动流出），再用合适的缓冲液冲洗三倍体积（如生理盐水或者PBS等）。
当最后一次加缓冲液后，把柱上层弄平整。等上层溶液完全流完，就可以加入待过柱的标记液。用去尖吸头小心的中空滴加，如果一次加不完，等流出少量后再加，一直加完。待标记物完全流干后，再加入少量约3－5滴缓冲液（如生理盐水或者PBS等），流完再加，如此三次左右，接着就可以一次加入1－2ml缓冲液（如生理盐水或者PBS等）。加到一定体积后，可以看到柱中黄色会分层。收集下层溶液，加入适当的稳定剂等，定溶。备用。
用过的凝胶可以丢弃或者重复使用（如果重复使用，须用大量的缓冲液冲洗，待上层黄色完全流走。折中的方法是小心的将上层黄色胶挖掉。流下层的回收）
FITC标记套装
| 组成 | 规格 | 保存条件 |
| FITC | 10mg | -20℃ |
| DMSO | 10ml | RT |
| 0.2M PH9.5 CB | 100ml | 2－8℃ |
| 1M NH4Cl | 1ml | 2－8℃ |
| Sephadex G-25 | 100ml(约50%含量) | 2－8℃ |
| 层析空柱（10ml） | 一套 | RT |
| 透析袋MD25(8000-14000) | 20CM | 2－8℃ |
| 铁夹（夹透析袋） | 两支 | RT |
产品说明：本套装是将FITC标记的常用试剂集合为一体而成。适合于蛋白等含有氨基物质的标记。特别是抗体的标记。
如果待标记物分子量太小（如小于5KD），可能并不适合用此套装（主要是后期纯化去除未标记上的FITC，可选用透析袋）。
标记原理：在高PH下FITC可蛋白等分子的氨基相连，形成共价健。
操作方法：
一，标记量的计算：FITC分子量为389.4。一般为FITC：待标记物＝10：1左右。比如抗体IgG分子量一般为150－160KD。则1mgHRP可标记抗体40mg之间。
二，计算好各步反应时间。作好开始标记的准备工作。因为标记是在PH为9.5的条件下反应，如果待标记物本身盐含量很低并且缓冲力差，如生理盐水，可等二天再准备。如果不确定，将0.2M PH9.5 CB稀释20倍，作为透析液，将待标记物装入透析袋中4℃透析过夜，透析袋适当留长约1ml体积的量以备第二天加入酶（透析袋用双蒸水清洗三次，祥细使用请见附录）。
三，如果样品缓冲能力很小（固体可用水溶解），加入1/20体积的0.2M PH9.5 CB，混匀。
四，准备层析柱（使用方法见附录）。
五，在样品准备好的情况下，称量2mg左右FITC（请不要一次称量过小，称量过小时，误差会很大），加入1ml DMSO溶解。取适量溶解好的FITC，加入准备好的样品迅速混匀。避光常温反应两小时或者4℃反应过夜。
六，加入1/20体积的1M NH4Cl，避光4℃反应两小时。
七，过柱。请保证总溶液体积不超过总体积的1/5。比较理想的是在1/10。也就是10ml凝胶，最多过柱1ml的标记液（此步也可以改为透析。一般避光透析两天左右，到没有明显黄色出来为止）。
附透析袋使用方法：
本透析袋已预处理过，用双蒸水清洗后将水用适当吸一下。就可直接使用。透析袋上下都可以用铁夹，但如果铁夹不够用，下部可用细线或者其他的透析袋夹。
将透析袋轻轻的折上两到三折。用线或者透析袋夹封住，上面支开，加入待透析物，留一定量的空气在顶上，并小心的折一折，用铁夹夹住，轻轻的挤压，如没发现有液体流出，可放入透析液中。一般透析可用纯净水瓶去顶使用。用一次性筷子或者其他合适物穿过铁夹，将透析袋吊在透析液中，补充透析液，使透析液盖过透析袋中的液面而不要淹过铁夹下面。
分子筛柱使用方法：
取空柱，加入双蒸水冲洗三次，找一合适的地方架好，下面收集废液，将Sephadex G-25取出摇匀，轻轻的沿壁倒入柱中（用去尖移液器加入也可以），等液体流出少量时，不停的补加凝胶到一合适的体积。一般加到10ml左右。在上口留出1－2ml空间。灌完胶后，用三倍体积的双蒸水冲洗（从上面加入，下面自动流出），再用合适的缓冲液冲洗三倍体积（如生理盐水或者PBS等）。
当最后一次加缓冲液后，把柱上层弄平整。等上层溶液完全流完，就可以加入待过柱的标记液。用去尖吸头小心的中空滴加，如果一次加不完，等流出少量后再加，一直加完。待标记物完全流干后，再加入少量约3－5滴缓冲液（如生理盐水或者PBS等），流完再加，如此三次左右，接着就可以一次加入1－2ml缓冲液（如生理盐水或者PBS等）。加到一定体积后，可以看到柱中黄色会分层。收集下层溶液，加入适当的稳定剂等，定溶。备用。
用过的凝胶可以丢弃或者重复使用（如果重复使用，须用大量的缓冲液冲洗，待上层黄色完全流走。折中的方法是小心的将上层黄色胶挖掉。流下层的回收）
| P0910 | 0.01M PBS(干粉) PH7.2-7.4 | NobleRyder | 2L | 8.00 |
| P0930 | 0.1%胰蛋白酶液消化液 | NobleRyder | 10ml | 120.00 |
| A0970 | 10×多聚赖氨酸溶液(免疫组化) | NobleRyder | 10ml | 260.00 |
| A0980 | 4％多聚甲醛 | NobleRyder | 100/500ml | 60.00/200.00 |
| A0940 | AEC显色试剂盒(20×) | NobleRyder | 1ml/10ml | 100.00/400.00 |
| A0960 | BCIP/NBT显色试剂盒 | NobleRyder | 100ml | 380.00 |
| A0950 | DAB显色试剂盒（20×） | NobleRyder | 3ml | 100.00 |
| P1150 | FITC标记套装 | NobleRyder | 一套 | 640 |
| P0010 | Mayer';苏木素染液 | NobleRyder | 10ml/100ml/500ml | 60.00/240.00/680.00 |
| P1140 | 抗体稀释液(一抗稀释液) | NobleRyder | 10ml/100ml | 40/280 |
| A0990 | 抗荧光衰减封片剂 | NobleRyder | 5ml/25ml | 70.00/240 |
| P1100 | 辣根过氧化物酶（HRP）标记套装 | NobleRyder | 一套 | 560 |
| P0020 | 柠檬酸钠缓冲液0.01mol/L，pH6.0， | NobleRyder | 1L | 8.00 |
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文献和实验相关实验
当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark
ml三蒸水中即成； 方法与步骤： 根据Marshall氏法高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白。 1. 用0.15 mol/L NaCl的盐水及0.15 mol/L pH9.0的NaHCO3-Na2CO3缓冲液稀释使每毫升内含抗体10mg，缓冲液为总量的10%； 2. 将以上溶液降温至4℃，按蛋白：荧光素=50—80mg：1mg的比例加入异硫氰酸荧光素，在0—4℃下电磁搅拌12—14h； 3.用半饱和硫酸铵将标记球蛋白
5. 过柱。取透析过夜的标记物，过葡萄糖凝胶G-25或G-50柱，分离出游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。
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