抗荧光衰退封片剂

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项

一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS （1：1）。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。 5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性

一文理清免疫荧光实验流程和常见问题

。 7. 光漂白 减少照明强度/时间。 选用抗荧光淬灭封片剂。   二、背景太高了怎么办？ 大家在操作时可以通过设置对照，帮助我们迅速判断背景的来源。对照包括自发荧光对照（无一抗、二抗）和无一抗对照。 1. 封闭不足 选用二抗种属来源的血清封闭。 选用链霉亲和素/生物素系统，需要用链霉亲和素封闭内源的生物链酶。 选用HRP系统，需要使用过氧化氢等商业化试剂盒去活化内源性HRP。 选用AP系统，需要使用左旋咪唑等商业化试剂去活化内源

【五分钟讲实验】F-actin 怎么看？一篇讲清鬼笔环肽染色和避坑要点

后，PBS 避光洗涤 3 次，每次 5 min。随后使用 DAPI 或 Hoechst 进行细胞核复染 5-10 min。洗涤后加入抗荧光淬灭封片剂封片，并使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜采集图像。 若样本为钛合金支架、3D支架或厚样本，建议采用 Z-stack 扫描并进行最大强度投影，以更准确评估细胞骨架分布、铺展形态及细胞黏附状态。     五、好结果长什么样？ 理想的鬼笔环肽染色不是一片均匀发光，而是能清楚看到F-actin的空间分布。 贴壁细胞中常见细胞边缘、应力纤维、胞质微丝