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- 2025年07月08日
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文献和实验操作篇：western blot 之 SDS－PAGE 电泳
20-50μl 蛋白（注意：根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。 取出上样样品至 200μl 的 EP 管中，加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×。（上样总体积一般不超过 15μl，加样孔的最大限度可加 20μ 样品，其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到 40μl，胶做得很好的话 50μ 也是问题不大的）上样前要将样品于沸水中煮 5-10 min 使蛋白变性。 本人心得：可以使用 PCR 仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮
10孔梳子插入玻璃板之间。确保无气泡产生（图 7）。让浓缩胶聚合60分钟。 •在900 ml蒸馏水中稀释100 ml 10 X缓冲液，并添加SDS, 制成最后浓度为3.5mM的 SDS-PAGE电泳缓冲液。 •将两个翼型扳手均匀施力掰开，从灌胶模具中取出凝胶三明治夹。通过灌胶模具背后留的两个大孔，轻轻向上将三明治夹推出（图 8）。 •将电极放入垂直电泳槽内。贴着电极壁，将凝胶三明治夹垂直方向插入电极中（图 9）。 •把凝胶三明治夹置于合适的位置后，关闭电极门（图10）。
min, 12000rpm离心5-10min，（7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上样量30ug） 7．加入下槽液，把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽，加入上槽液，上样。 8．连接电源，5-10mA/胶开始电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到10-15mA/胶， 9．溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳，取出凝胶，做好标记，准备染色。 10．染色。见考马斯亮蓝染色操作规程及银染色操作规程。 11．扫描。扫描操作见扫描仪的使用说明。 注意事项 1．在加
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