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- 2025年10月24日
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深圳子科生物
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文献和实验性笔在组织周围画圈，然后滴加稀释好的一抗，如果做阴性对照实验，就在对照组的组织上滴加 PBS。加完一抗后于 4 °C湿盒中孵育过夜。（抗体的最佳稀释比应预先通过实验确定，时间控制在 15h 以上）。 PBS 冲洗切片 3 次，每次 3 min，吸水纸擦干切片后滴加辣根过氧化物酶标记二抗 ，37 ℃ 孵育 30 min。 信号检测 PBS 冲洗切片 4 次，每次 3 min，甩去 PBS 液体后吸水纸擦干切片，每张切片滴加新鲜配制的 DAB 显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，时间
底物范围较广，包括二氨基联苯胺 (DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。 二氨基联苯胺/金属盐 DAB 是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。它产生强烈的棕色产物，在水和醇中不溶解。多数情况下，推荐在 DAB 中加入不同的金属离子。当加入金属盐如钴、镍至底物液中，辣根过氧化物酶可以更加敏感。此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色，且在水及醇中稳定。DAB/金属盐染色应用的组织染色范围较广。 1. 需要的溶液和特殊设备 DAB，0.05 mol/L Tris 缓冲液 (pH7.6), 0.3％ (W
或细胞中目的抗原表达水平低：可延长DAB显色时间或延长二抗孵育时间。 （3）试剂超过有效使用期：及时更换试剂。 （4）操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释：可每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）。 （5） 蛋白封闭过度：封闭时间不要超过 2h。 Q3：为什么出现高背景染色，怎么办？ （1）一抗浓度过高：对抗体进行滴定以确定获得特异性反应的最佳浓度。 （2）显色过度：缩短显色试剂 DAB 孵育时间。 （3）洗涤不充分：适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间。 （4）封闭
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