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- 高通量Multi-PCR NGS 靶向甲基化位点定量
- 北京西城
- 2025年07月13日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
博淼生物
- 服务名称：
多重PCR靶向甲基化测序
MultiPCR 区域甲基化测序服务
内容简介
伴随EWAS芯片技术在DNA甲基化的广泛应用，及多基因复杂疾病的表观遗传研究，更多易感的5mC位点及区域发现，由此需要高通量、高准确度、价格低廉的检测技术满足大样本检测的需求。博淼生物结合多重PCR扩增子技术和NGS技术，针对靶向区域进行DNA甲基化定量检测。
技术原理
多重PCR扩增子NGS靶向DNA甲基化定量技术技术原理，首先通过重亚硫酸盐处理，甲基化的C被保护，而未甲基化的C则被修饰为U；其次通过基于多因素算法设计合成目标区域特异的DNA甲基化多重PCR扩增引物，分别以上述CT处理之后的DNA单链为模板进行目标区域的多重扩增，每个多重PCR反应体系中最多可以容纳100个片段，每个区域长度在100-250bp；再者通过磁珠纯化产物并根据不同反应体系的扩增产物扩增，通过第二轮带有测序接头的通用PCR引物进行扩增建库；最终将建库产物进行超高深度NGS测序，平均测序深度可达1000×以上，根据CpG site中非甲基化和甲基化对应的T和C碱基的测序reads数量进行单个5mC位点的甲基化程度统计。服务项目
| 项目名称 | 位点数量 | 技术特点 |
| MultiPCR 区域甲基化测序 | 20-100个片段或＞1000× | 片段长度约100-150bp,高通量，成本低廉，是EWAS芯片二期靶向位点验证的理想技术选择之一。 |
技术优势
·超高重的测序深度
·完善而创新的EWAS芯片位点优化策略
·丰富的引物设计经验
服务流程
位点信息提供-方案设计-预实验-正式实验-数据分析
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文献和实验每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵。 3 甲基化特异性的PCR (methylation-specific PCR, MS-PCR) Herman等1996年在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。它将DNA先用重亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性的PCR。MS-PCR中设计两对引物，并要求：1.引物末端均设计至检测位点结束;2.两对引物分别只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对
高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的桑格测序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer
。Oefner等1992年[20]提出变性高效液相色谱法（DHPLC）用于分析单核苷酸和DNA分子。邓大君等2001[21]将其改进与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增，由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞嘧啶，因此原甲基化的在PCR扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长，这样就可以测定出PCR产物中甲基化的情况。 这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的片段中所有CpG位点甲基化
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