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- 2025年09月30日
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- 技术资料
- 供应商：
蒂科生物
- 样本：
详询
- 库存：
5000
- 标记物：
详询
- 适应物种：
详询
- 应用：
检测细菌污染
- 检测方法：
荧光定量PCR法
- 检测范围：
详询
- 规格：
120T
【产品名称】 细菌核酸检测试剂盒(荧光定量PCR法）
Detection Kit for Nucleic Acid of bacteria (Fluorescence quantitative PCR)
【包装规格】
500次反应/盒
【预期用途】
本试剂盒用于定性检测细胞中细菌污染情况，主要用于检测临床放行前的终产品细胞是否受细菌污染，但不能用于鉴定细菌种类。
【检验原理】
本试剂盒选用针对细菌同源基因片段16s rRNA设计特异引物，本试剂盒利用SYBRGreen荧光染料能与引物扩增的DNA摸板发生特异性结合，在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。
【主要组成成份】
| 序号 | 组分名称 | 装量 | 管数 | 主要成份 |
| 1 | PCR反应液 | 10 ml | 10 | 含引物、Taq酶、buffer、dNTP、MgCl2 |
| 2 | 阳性对照 | 1ml | 1 | 细菌培养物 |
| 3 | 阴性对照 | 1ml | 1 | Nuclease-free 水 |
| 4 | 标准品 | 100 μl | 1 | 重组质粒(108拷贝/μl) |
| 5 | 1×TE buffer | 1ml | 1 | Tris-HCl和EDTA |
| 6 | 参比染料 | 1ml | 1 | ROX Reference Dye |
【储存条件及有效期】
试剂储存在-20℃保存，产品有效期为12个月，未使用完的试剂继续冷冻保存不影响其稳定性。短期储存4℃可保存一个月。试剂反复冻融不得超过5次。
【适用仪器】
具有SYBR荧光检测通道的ABI 7300/7500、ABI 7500 Fast、LightCycler 480等实时荧光定量PCR仪。
【样本要求】
检测样本类型为细胞上清或细胞悬液，检测对象是临床放行的终细胞产品，在准备好放行细胞的同时取细胞上清检测。样本收集在无菌的1.5ml EP管中，样本量1ml。样本在检测前可放与4℃ 24h，如若长期放置，可在-20℃以下存放。
【检验方法】
- 标准曲线制备（阳性区）
| 编号 | 1×TE buffer用量 | 标准品用量 | 拷贝数 | |||
| 1 | 1` | 9 μl | 9 μl | 1 μl标准品 | 1 μl标准品 | 107 copies/μl |
| 2 | 2` | 9 μl | 9 μl | 1 μl样品1 | 1 μl样品1` | 106 copies/μl |
| 3 | 3` | 9 μl | 9 μl | 1 μl样品2 | 1 μl样品2` | 105 copies/μl |
| 4 | 4` | 9 μl | 9 μl | 1 μl样品3 | 1 μl样品3` | 104 copies/μl |
| 5 | 5` | 9 μl | 9 μl | 1 μl样品4 | 1 μl样品4` | 103 copies/μl |
| 6 | 6` | 9 μl | 9 μl | 1 μl样品5 | 1 μl样品5` | 102 copies/μl |
- 阳性对照处理（阳性区）
- 样本处理（样本处理区）：
（2）阴性对照取出20 μl，100℃水浴或金属浴处理10 min，12000 rpm离心5 min，备用。
3. 加样（试剂准备区）
从试剂盒中取出 PCR反应液，在室温下融化，振荡混匀，PCR反应体系如下，阴性、阳性对照反应体系与其一致：
| 组分名称 | 加样量 |
| PCR反应液 | 18.5 μl |
| 参比染料 | 0.5 μl |
| 模板 | 1 μl |
| 总体积 | 20 μl |
| 组分名称 | 加样量 |
| PCR反应液 | 17.5 μl |
| 参比染料 | 0.5 μl |
| 阳性对照 | 1 μl |
| 待检测样品 | 1 μl |
| 总体积 | 20 μl |
将反应试剂混匀后简短离心离掉壁上液体，各反应管按一定顺序放入PCR仪上，按以下程序进行PCR扩增：
| 阶段 内容 | Stage1 （预变性） |
Stage2 （PCR反应） |
Stage3 （扩增产物熔解曲线） |
|||||
| 温度 | 95℃ | 95℃ | 58℃ | 72℃ | 95℃ | 60℃ | 95℃ | 60℃ |
| 时间 | 10min | 20s | 30s | 30s | 15s | 1min | 15s | 15s |
| 循环数 | 1 | 40 | 1 | |||||
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文献和实验化作用——氧分子、过氧化氢、氧自由基 5. 表面活性剂和去污剂 6.变性剂——脲和盐酸胍、高浓度盐、螯合、有机溶剂 7. 重金属离子和巯基试剂 8. 热 9. 机械力 10. 冷冻和脱水 11. 辐射 5. 酶活计算 ① 酶活定义 酶的活力单位：酶的1个活力单位是在该酶的最适条件下，在25℃、1 min内催 1μmol的底物转化为产物的酶量。 ② 定时法的计算 将酶与底物在特定条件下孵育，酶促反应开始进行，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可
时样本之间干扰。 Q：说明书上写细胞量为 1~5 × 105 ，细胞量多的话对检测结果有没有影响？ A：建议细胞量最多不要超过 106个，过量的细胞相当于染料被稀释，影响染色和分离效果。一般 2×105 个细胞足够进行凋亡检测了，通常情况下检测 10,000 个细胞就能得到比较好的结果。 Q：是否可以用 PBS 替代凋亡试剂盒里面的 Binding Buffer？ A：不行，Binding Buffer 是必须要加的，Annexin V 与 PS 的结合依赖 Ca2+，Binding
针对同一指标，生化试剂盒和 ELISA 试剂盒的检测结果趋势是一致的吗？
一、两种方法检测原理 两种方法的基本原理都是朗伯-比尔定律，但是具体形成过程和检测的方法不一样的。 1) 生化试剂盒检测原理 生化试剂盒检测的本质就是某物质化学变化的显色反应，其反应过程可以划分为四个区：延迟区、等速区、过渡区和平衡区，以时间为横坐标、吸光度为纵坐标作图，如下所示： 延迟区：无规律可寻。 等速区：对应的是速率法，一般应用于酶活力的检测。 过渡区：对应的是固定时间法，目的是解决某些化学反应的非特异性问题，提高准确度。 平衡区：对应的是终点法，主要是测定某物质在样本中的含量。 目前
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