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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存:
27
- 英文名:
详见说明书
- CAS号:
详见说明书
- 保质期:
一年
- 供应商:
上海一研
- 保存条件:
4°C保存
- 规格:
100T/盒
HBG mRNA原位杂交试剂盒准备工作:缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml 蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,pH2.0 左右。
2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g,柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O,分子量 294)8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸馏水加 100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸馏水加 30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。
0.5 M PBS——1000ml 蒸馏水加氯化钠 30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g,PH7.2-7.6。
产品名称:HBG mRNA原位杂交试剂盒
规格:100T/盒
特异性: 人
标记方式: 3’—尾段标记
保存条件: 4°C保存一年
试剂盒内容:
1.HBG寡核苷酸探针杂交液 2ml;
2.预杂交液 2ml;
3.胃蛋白酶(×10;Pepsin) 2ml;
4.封闭液 5ml;
5.生物素化鼠抗 5ml;
6.SABC-POD 5ml;
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
原位杂交检测步骤:
原位杂交涉及的步骤:玻片的准备和样品固定,细胞或组织的预渗透处理,靶DNA变性(DNA原位杂交),探针制备,原位杂交过程,杂交后洗涤,探针(显色)检测。
1. 玻片的准备和样品固定
对于染色体涂片,1:1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交,为了在实验过程中不丢失组织样品,可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤,从化学反应角度来看,固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大,因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中,而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片,常使用甲醇/固定;石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的中固定30min,或使用Bouin固定剂。
2. 样品预处理
在待测样品中,DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕,根据不同的细胞和组织样品的应用,可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露:
内源性酶灭活:如果探针的检测是通过酶促法进行的,则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的处理30min。如果检测酶为AP,可在底物溶液中加入左旋咪唑,AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多,因为在杂交过程中,样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
RNase处理:在DNA-DNA杂交实验中,RNase的处理可去除内源性RNA,增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时,RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml),样品在溶液中37℃处理60min。
SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液(pH7.4)
HCl处理:对样本进行20-30min的200mM HCl处理,可将蛋白抽提,并将核酸序列进行一定程度的水解,增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理:如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸,可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如Triton X-100和SDS)。
蛋白酶处理:样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起,样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度,因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤,通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源,蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶浓度可根据具体样品进一步优化),对样品进行37°C 7.5 –30 min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5 min。也有文献指出,福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品,使用胃蛋白酶(500μg/ml,溶于200mM HCl)将得到较好的蛋白消化结果。
对于结缔组织,肝组织等样品,还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理,以降低背景。
3. 探针制备
在进行研究前,确定应用的探针类型。不同探针类型的优劣势请见上文描述。DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化(或cDNA的克隆)和酶促探针标记,可选随机引物标记法和缺口平移法等。RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段,再进行末端标记或加尾法探针标记。但无论采用何种标记探针及标记方法,对探针标记效果需进行最终的评估,并准确计算探针浓度。
4. 原位杂交过程
杂交前可进行预杂交,以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同,只是预杂交液中不含探针和硫酸葡聚糖。
靶DNA的变性(对mRNA的原位杂交无需此步)
样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤,但同时可能会造成样品形态学的部分破坏,此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性,实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
如使用热变性方法,可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行:将样品和探针溶液加盖盖玻片,置于烘箱80℃变性,染色体DNA样品处理2min,后冷却至37℃进行杂交。组织样品DNA的变性时间可增加至80℃10min。
杂交流程:
杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。杂交液的基础成分为:Denhardt’s溶液(Ficoll,BSA,PVP),异源核酸(如鲱精子DNA/tRNA/竞争DNA),磷酸钠,EDTA,SDS,盐离子,甲酰胺和硫酸葡聚糖,以及杂交探针。不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。常用的pH范围为6.5~7.5,较高的pH值有助于提高杂交的严谨性。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性,较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度,对Tm值、双链复性速率的影响不大,但随着Na离子浓度的降低,将显著影响Tm值和双链复性速率。
有机溶剂(甲酰胺)的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的条件下变性,那么应用于原位杂交,样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性,这将导致样品形态学的破坏。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性,高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境,增加了探针浓度,加快杂交反应速率。
杂交常用条件:50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0
1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours
对于短链的寡核苷酸探针,具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性,可尝试从以下杂交条件开始优化:25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours。
以下是公司正在热销的产品:
小鼠促卵泡素(FSH)ELISA试剂盒储存条件: -20℃英文名称:O157 chromogenic medium
产品规格:1000(ML)
产品用途:用于O157菌的显色培养,O157菌显亮红色、淡红色或红色大肠杆菌O157:H7显色培养基是改良的培养基,用于食品、病人粪便样品中O157:H7菌的快速检测。O157:H7菌显亮红色、淡红色或红色,菌落周围没有蓝色晕圈,大肠杆菌和大肠菌群显暗蓝色、蓝色或紫色,菌落周围有蓝色晕圈;其它细菌显蓝色、黄色或无色。本培养基的特异性高,可以克服SMAC培养基引起的假阳性和假阴性结果,是一种很理想的快速检测培养基。
小鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)ELISA试剂盒储存条件: -20℃英文名称:Salmonella Chromogenic Medium
产品规格:1000(ML)
产品用途:用于沙门氏菌的显色培养沙门氏菌显亮红色用途:用于沙门氏菌的快速检测。用法称取本品 7.26g,加入 200ml 蒸馏水,加入添加剂 3ml,加热煮沸溶解并不停搅拌,加热 3-5 分钟。冷却至 45-50℃时,倾入无菌平皿。
小鼠催乳素(PRL)ELISA试剂盒英文名称: Rabbit anti-HRP英文名称:Listera Chromogenic Medium
产品规格:1000(ML)
产品用途:用于李斯特氏菌的显色培养,单增李斯特氏菌显蓝色,外围有一不透明环李斯特氏菌显色培养基是高科园生物技术有限公司研制,可快速检测食品和药品中单增李斯特氏菌。阴性结果可在3天内检测完成。单增李斯特氏菌显蓝色,菌落周围有一不透明环。蛋白胨提供氮源和氨基酸,氯化钠维持渗透压,琼脂是凝固剂,氯化锂抑制革兰氏阴性菌生长,抑菌剂抑制除李氏菌外的革兰氏阳性菌生长。
小鼠抵抗素(Resistin)ELISA试剂盒储存条件: -20°C英文名称:Staphylococcus Chromogenic Medium
产品规格:1000(ML)
产品用途:用于金黄色葡萄球菌的显色培养,金黄色葡萄球菌显蓝绿色金黄色葡萄球菌显色培养基是公司改良的培养基,用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中金黄色葡萄球菌的快速检测,24小时内出结果。金黄色葡萄球菌显蓝绿色菌落,李斯特氏菌显紫色,绝大多数革兰氏阴性菌被抑制。用法称取本品17.26g 加入200ml蒸馏水,加热完全溶解,煮沸2-3min,冷至50℃左右时,倾入无菌平皿,备用。贮存制备好的平板可保存2-5天,应避免光线直接照射。干燥培养基应放置于阴暗干燥处, 保存温度2-8℃,注意避光保存。失效干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。操作步骤涂布法:1、按、SN标准、ISO标准或其它方法制备样品液;2、取1ml适宜稀释度的样品液加入表面干燥的金黄色葡萄球菌显色培养基平板中心,每个稀释度做2个平板;3、以L形玻璃棒将样品液涂布于琼脂表面,避免涂到平板边缘,将平板正置直至样品液被培养基吸收;4、平板倒置放入培养箱36±1℃培养18-24h,典型的金黄色葡萄球菌为凸起的蓝绿色菌落;5、计数平板上所有凸起的蓝绿色菌落。划线法:1、按、SN标准、ISO标准或其它方法制备样品液;2、取10ul-20ul样品液划线接种于已凝固好的金黄色葡萄球菌显色培养基平板上;3、倒置放入培养箱36±1℃培养18-24h,典型的金黄色葡萄球菌为凸起的蓝绿色菌落;注意:金黄色葡萄球菌镜检为革兰氏阳性球菌,且兔血浆凝固酶试验为阳性。
小鼠骨钙素/骨谷氨酸蛋白(OT/BGP)ELISA试剂盒储存条件: -20℃英文名称:
产品规格:1000(ML)
产品用途:用于霉菌和酵母菌的显色培养霉菌和酵母菌显色培养基是公司改良的培养基,用于霉菌和酵母菌的显色培养。
小鼠血管舒缓激肽(BK)ELISA试剂盒宿主: Mouse 英文名称:Vibrio Chromogenic Medium
产品规格:1000(ML)
产品用途:用于弧菌的显色培养,副溶血性弧菌显蓝色,霍乱弧菌显红色,其它弧菌显红色或无色。弧菌显色培养基是公司改良的培养基,用于食品、海产品、病人粪便样品和水产品中弧菌的快速检测。弧菌显绿色且菌落比较大,霍乱弧菌显红色,其它弧菌显红色、蓝色或无色且菌落比较小;其它细菌绝大部分被抑制。本培养基的特异性高,可以克服TCBS培养基引起的假阴性结果,是一种很理想的快速检测培养基。
HBG mRNA原位杂交试剂盒人卵泡抑素检测试剂盒
英文名称:Human Follistatin ELISA KIT
反应性:Human
样品类型:Serum, plasma, Cell culture supernatant
灵敏度:23 pg/ml
检测目标:Follistatin
应用:Sandwich ELISA
风险提示:丁香通仅作为第三方平台,为商家信息发布提供平台空间。用户咨询产品时请注意保护个人信息及财产安全,合理判断,谨慎选购商品,商家和用户对交易行为负责。对于医疗器械类产品,请先查证核实企业经营资质和医疗器械产品注册证情况。
文献和实验原位杂交法测定TNF的mRNA 原位杂交 【试剂及配制】 (1) TNF-DNA探针 (2) 地高辛标记液试剂盒 (3) 杂交液:60%去离子甲酰胺,300mmol/L NaCl、30mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L EDTA 25mmol/L NaH2 PO4 (pH7.4),5%葡聚糖硫酸酯,250μg/μl变性鲑精DNA (4) 设备:温箱,水浴
试剂盒 公司 型号 次数 价格 推荐指数 mRNA提取 生工 SK1411 10次 750 SK1412 20次 1100 mRNA提取 invi K1580-96 TAKARA 23006 6 rxns 7059 mTRAPTMMaxi 23506 5 x 6 rxns 30019
相机拍照时,上色的 RNA 胶要尽可能少接触紫外光,若接触太多或白炽灯下暴露过久,会使 RNA 信号降低。从琼脂糖凝胶中分离功能完整的 mRNA 时,甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂,但是有毒,因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免 RNase 的污染。5. 组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落的原位杂交不同,菌落原位杂交需裂解细菌释出 DNA,然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后,使细胞通透性增加
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