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- 2025年07月10日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
57
- 英文名：
Cell Membrane Fixation Buffer
- 保质期：
详见说明书
- 供应商：
上海研生
- 保存条件：
低温冷藏
- 规格：
50ml
一、细胞膜固定剂哪家好分离与培养：
1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%在室温条件下固定细胞15min；
2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
中文名称：细胞膜固定剂哪家好英文名称：Cell Membrane Fixation Buffer
产品规格：50ml
发货周期：1～3天
固定剂、破膜剂用于细胞内细胞因子染色前对细胞膜的处理。固定剂起稳定细胞膜、保持细胞膜表面抗体与抗原结合的作用；破膜剂使流动的、完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞。用流式细胞仪检测细胞内抗原及DNA时，对待测细胞进行固定、破膜处理后，加入相应抗体或检测试剂，孵育一定时间即可上机分析。
产品组分
4%、NaOH、NaH2PO4、1%胎牛血清；pH7.4-7.6
应用实例
1.收获待测细胞，1000rpm离心10分钟，弃上清。
2.加入500ul预冷(4℃)固定剂。
3.室温孵育10分钟。
4.1000rpm离心10分钟。
5.弃上清，加入PBS洗一次，1000rpm离心10分钟。
6.弃上清，加入1.5ml破膜剂。
7.室温孵育10-15分钟。
8.1000rpm离心5分钟。
9.弃上清，加入适量破膜剂重悬细胞。
10.加入检测抗体进行染色后，用流式细胞仪进行分析。
储存条件4℃避光，勿冰冻，有效期一年。
注意事项：
尽管经测试Annexin V-FITC反复冻融5次对于其检测效果无显著影响，但为取得良好的使用效果，3-6个月内推荐4℃保存，并适当注意避免反复冻融。
如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，导致染色失败。
荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测，这样通常可以有效减少假阳性的坏死细胞。
需自备PBS。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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培养操作步骤：
1．用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布；
2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）；
3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时；
4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中；
5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。
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文献和实验与蛋白质发生交联反应，形成网络，保持蛋白质的位置和结构，是最常用的固定剂。在少数情况下，可能会用到有机溶剂类固定剂，如甲醇、丙酮等。它们是通过变性蛋白质的方式对组织进行固定。具体使用何种样本固定剂，可查看特定的抗体说明书。「妆前乳」——通透细胞膜固定好样本的「容貌」之后，为了帮助「化妆品」进入细胞，贴合抗原，需要进行细胞膜通透的步骤。通透，就是在细胞膜上打孔，使封闭液和抗体能够进入细胞。一般情况下，采用醛类固定剂固定的样本需通透细胞膜，而有机溶剂类固定剂本身就可以通透细胞膜，固定后的细胞不需要再增加
蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。 固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。 2. 透化 通透的目的是使抗体进入胞内。0.5% Triton X-100 室温通透20 min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了Triton X-100，丙酮也可作为通透剂，并且丙酮固定后的样品不需要通透。 3. 封闭 封闭可减少
一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂
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